Bu protokol, piggyBac tabanlı dönüşüm sistemi kullanılarak transgenik Sonbahar Ordu kurdu üretimini göstermektedir. Bu yöntemlerin sadece Sonbahar Ordu Kurdu'nda değil, aynı zamanda lepidopteran böceklerde de dönüşümün iyileştirilmesine fayda sağlayacağını umuyoruz. Burada açıklanan yöntem, lepidopteran haşere böceklerinin germline dönüşümini verimli hale getirir.
Prosedürü gösteren dr. Xien Chen olacak, laboratuvarımda doktora sonrası bir arkadaş. Bir kutuya 12 erkek pupa ve 12 dişi pupa yerleştirerek başlayın. Yetişkinleri beslemek için kutuya% 10 sakkaroz çözeltisi yerleştirin.
Kutuyu kağıt havluyla kaplayın. İkinci gün eklosyon sonrası, yetişkinleri bir gecede yoğun ışığa maruz bırakın. Eclosion sonrası üçüncü günde, yetişkinleri karanlık bir yere aktarın.
Embriyoları pozisyon bittikten sonra iki saat içinde toplayın. Kağıt havlunun parçasına, buz üzerinde bir Petri kabında tutulan taze yumurtalarla su damlaları ekleyin. Yumurtaları ince bir fırça ile hafifçe cam bir kaydırağa aktarın ve cam bir kaydırağa tek tek hizalayın.
Mikroenjeksiyondan önce yumurtaları buz üzerinde hizalanmış olarak cam slaytları tutun. Mikroliter piggyBac tabanlı EGFP ekspresyon plazmid, mikroliter hiperaktif piggyBac transposase mRNA başına 200 nanogram ve steril damıtılmış suyun bir karışımını otomatik mikroinjektörün kompanzasyon basıncını kullanarak yumurtalara enjekte edin. Enjekte edilen yumurtaları yumurtadan çıkana kadar 27 artı veya eksi bir santigrat derece, 60 artı veya eksi% 10 bağıl nemde tutun.
Yumurtadan çıkan larvaları yapay bir diyetle besleyin ve her larvayı erken lor ve yıldız aşamasında küçük bir kaba aktarın. Pupaları toplayın ve yaklaşık 150 dişi ve 150 erkek pupayı bir kafese yerleştirin. Yumurtaları toplamak için kafese 30 santimetreye 15 santimetre büyüklüğünde birkaç kağıt havlu parçası asın.
Kağıt havluları günlük olarak yumurtalarla toplayın ve yumurtadan çıkana kadar yumurtaları uygun koşullarda saklayın. Yenidoğan larvalarını hareketsiz hale getirmek için beş dakika boyunca dört santigrat derecede tutun ve sonra buz gibi bir tabağa aktarın. Hareketsiz yenidoğan larvalarını floresan stereo mikroskop altında tarayın.
EGFP pozitif yenidoğanları seçin, yaklaşık iki hafta içinde 27 artı veya eksi bir santigrat derecede pupal aşamasına yükseltin. Hiperaktif piggyBac transposaz mRNA sentezlenmiş in vitro%1 Agarose jel kullanılarak tespit edildi. PDS enjekte edilen embriyolarda EGFP sinyali görülmezken, EGFP ekspresyörlü plazmid ve hiperaktif piggyBac transposaz mRNA enjekte edilen embriyolarda EGP floresan gösterilmiş, bu da piggyBac konstrüksiyonun başarılı olduğunu göstermiştir.
G0 yetişkinlerinin kendi kendine çaprazından kaynaklanan yumurtalardan elde edilen G1 larvaları güçlü bir EGFP sinyali gösterdi. Organizatör ve EGFP parçasını içeren bir parça, EGFP pozitif larvalardan izole edilen genomik DNA şablon olarak kullanılarak başarıyla yükseltildi. Bununla birlikte, genomik DNA şablon olarak vahşi tip larvalardan izole edildiğinde aynı parça tespit edilmedi.
Mikroenjeksiyon için yumurtalar mümkün olduğunca taze olmalı ve gelişimlerini yavaşlatmak için mikroenjeksiyondan önce her zaman buzda tutulmalıdır. Bu teknik, araştırmacıların haşere böcek fonksiyonel genomiklerindeki soruları yanıtlamalarının ve bu küresel haşere için genetik kontrol yöntemleri geliştirmelerinin yolunu açmaktadır.
