Dieses Protokoll erleichtert die Verwendung von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten Neuronen für Hochgehalt-Screening-Anwendungen. Es eignet sich besonders gut für die Aussage von Synapsen, die in menschlichen Neuronen lange Kulturperioden erfordern. Wir zeigen die Replating von Neuronen von großformatigen Gerichten in HCS-kompatible Multibrunnen in einer Weise, die ihre Lebensfähigkeit bewahrt.
Gegen-intuitiv zeigen wir, dass die Verlängerung der Protease-Inkubation vor der Resuspendation und Replatierung ein verbessertes neuronales Überleben ergibt. Menschliche pluripotente Stammzell-abgeleitete Neuronen sind zunehmend relevant in den Bereichen Grundlagenforschung, Arzneimittelentwicklung und degenerative Medizin. Diese sanfte Titrationsmethode kann verwendet werden, um jede große Monoschicht von Zellen mit einem dicken Netzwerk von Prozessen wieder aufzuhängen.
Zusätzlich zu menschlichen iPSCs kann es verwendet werden, um die Kultur der primären Neuronen neu zu plädienen oder sie für die Faktensortierung oder Einzelzellsequenzierung wieder auszusetzen. Es ist wichtig, die Protokolle Schritte sorgfältig zu folgen und häufig überwachen die Protease vermittelte Ablösung der Neuronen von der Platte. Die optimale Inkubationszeit kann je nach Kultur variieren.
Visuelle Demonstration ermöglicht es auch unerfahrenen Forschern, dieses Verfahren zu reproduzieren. Beginnen Sie mit dem sanften Spülen der Platte von differenzierten Neuronen mit PBS. Dispergieren Sie die PBS an der Wand der Platte und nicht direkt auf die Zellen, um sie nicht zu stören.
Aspirieren Sie die PBS vom Rand der Schale, während Sie sie kippen, wobei Sie darauf achten, die Zellen nicht zu berühren. Tragen Sie mindestens einen Milliliter proteolytischer Enzyme pro 10-Zentimeter-Platte auf. Und geben Sie die Zellen für 40 bis 45 Minuten in den Inkubator zurück.
Während der Inkubation überprüfen Sie Neuronen auf einem phasenweisen Kontrastmikroskop und setzen die Protease-Behandlung fort, bis sich das neuronale Netzwerk vollständig von der Platte löst und zu brechen beginnt. Wenn sich die Neuronen gelöst haben, stoppen Sie die Verdauung, indem Sie fünf Milliliter frische DEMEM-Medien für jeden Milliliter Protease hinzufügen. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um die Zellen fünf- bis achtmal sanft gegen die Platte zu tittieren, um sicherzustellen, dass nicht zu viel Druck ausgeübt wird.
Die Zellen durch ein 100-Mikrometer-Netz in ein 50 Milliliter konisches Rohr abtropfenlassen. Und spülen Sie das Sieb mit zusätzlich fünf Milliliter frischen DMEM-Medien. Verwenden Sie eine Tischzentrifuge, um die Zellen fünf Minuten lang bei 1000-fachm G nach unten zu drehen.
Nach der Zentrifugation, geben Sie die konische Röhre in den Biosicherheitsschrank zurück und aspirieren Sie die meisten Medien, so dass 250 Mikroliter übrig bleiben, um die Zellen feucht zu halten. Die Zellen in zwei Millilitern frischer DMEM-Medien vorsichtig wieder aufhängen und dann durch das Ende einer fünf Milliliter serologischen Pipette passieren. Schließlich invertieren Sie die Röhre zwei- bis dreimal.
Verwenden Sie ein Hämozytometer und Tripanblau, um die lebensfähigen Zellen zu zählen. Und dann DMEM zur gewünschten Konzentration. Fügen Sie dem Rohr je nach den Anforderungen der spezifischen Zelllinie geeignete Ergänzungen hinzu und mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie das konische Rohr zwei- bis dreimal kippen.
Aspirieren Sie Dielamininbeschichtung aus einer 24-Well-Platte und spülen Sie sie einmal mit PBS ab. Aspirieren Sie die PBS. Und wenden Sie Zelllösung auf jeden Brunnen in einer Figur acht Bewegung, um Klumpen zu vermeiden.
Wenn die Zellen plattiert sind, geben Sie die Platte an den Inkubator zurück, der auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid eingestellt ist. Kurz wirbeln die Bestandslösung des frühen Zelltodreporters und fügen Sie sie den Brunnen entsprechend den Manuskriptanweisungen hinzu. Warten Sie 20 Minuten.
Und dann bilden Sie die lebenden und toten Zellen auf Glasboden Multi-Brunnen. Die Verlängerung der Protease-Inkubation ermöglicht eine Lockerung des neuronalen Netzwerks innerhalb des angehobenen Zellblatts. Dies führt zu einem reduzierten Zelltod zum Zeitpunkt der Dissoziation sowie zu einer effizienteren Erholung in den folgenden Tagen.
Mit Hilfe des erweiterten Enzyminkubationsverfahrens weisen die Kulturen eine ungefähre Verdoppelung der Zelllebensfähigkeit in den Tagen nach der Replatierung und eine geringere Dichte von abgestorbenen oder absterbenden Zellen auf. Die Übergangsphase der neuronalen Differenzierung findet über mehrere Tage statt, in der die Zellen nach und nach neuronale Marker im spätstadium exprimieren. Diese Marker werden sofort in Kulturen nachgewiesen, die nach vier Wochen Vordifferenzierung neu plattiert wurden.
Das erweiterte Protease-Protokoll verbessert auch das Neurid-Auswuchs mäßig. Sowohl die Gesamtneuridlänge als auch das Dendritenwachstum werden verbessert. Replating ist auch nützlich für das Studium von Synapsen.
Nur eine Woche nach der Replatierung wurden Marker für prä- und postsynaptische Proteine beobachtet. Darüber hinaus ist elektrische Aktivität durch spontane Depolarisation und synaptisch angetriebene Ströme mit Kalzium-Bildgebung oder Multielektroden-Arrays nachweisbar. Dieses Replating-Verfahren kann an viele Arten von Anwendungen angepasst werden.
Zusätzlich zu high content Screening zur Identifizierung potenzieller therapeutischer Verbindungen könnte es für bildgebende Wachstumskegel oder Multielektroden-Array-Aufnahmen verwendet werden. Die mechanische Dissoziation von Neuronen, die bereits lange Prozesse gebildet haben, ist belastend. Eine längige enzymatische Inkubation und sanfte Titration von Zellen sind wesentliche Schritte für den Erfolg dieses Verfahrens.
