Die Autoren bedanken sich bei Dr. Y. Sasai für die großzügige Bereitstellung der FOXG1 Antikörper danken. Diese Arbeit wurde von Connecticut Stem Cell Research Grants (08-SCB-UCHC- 022 und 11-SCB24) und spastische Paraplegie Foundation unterstützt.

Ein. Generierung von humanen pluripotenten Stammzellen Aggregate (D1-D4) <ol><li> Menschlichen pluripotenten Stammzellen sind auf embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) Abzweige in Gegenwart von HES-Medium mit basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 4 ng / ml) kultiviert. Nach 5-7 Tagen in Kultur, wenn die Kolonien groß aber noch undifferenzierten sind, sind sie bereit für den nächsten Schritt. </li><li> Das Enzym Lösung sollte zunächst vorbereitet werden. In einem 50 ml-Röhrchen, löst den Dispase (oder Collagenase) bei einer 1 mg / ml-Konzentration in DMEM/F12 Medium. Da diese Lösungen zu mischen besten, wenn erwärmt, das Reagenzglas mit dem Medium und Enzym in einer 37 ° C heißen Wasserbad für 10 bis 15 min und dann unter Verwendung eines sterilisieren Steriflip Filter. </li><li> Absaugen das Medium aus den Zellen, spülen Sie sie mit DMEM/F12, und saugen diese ebenfalls ausgeschaltet werden. 1 ml Dispase in jede Vertiefung und in den Inkubator für 3-5 min für hESCs (bis zu 10 min für iPS). Schauen Sie sich die Zellen unter dem Mikroskop; wenndie Kanten zu wellen leicht / sehen ein bisschen dunkler, sind die Zellen bereit für den nächsten Schritt. Es ist am besten, um die Zellen nach 3 min zu überprüfen und setzen Sie sie wieder ein, wenn nötig. Bei Verwendung dieses Protokolls zum ersten Mal ist es empfehlenswert, mit nur einer Platte von Zellen zu einer Zeit zu starten, da es wichtig ist, die Zellen aus dem Dispase so schnell wie möglich zu entfernen. </li><li> Absaugen die Dispase aus den Zellen. Gently (die Zellen sind sehr anfällig in dieser Phase und kommen weg von der Platte relativ leicht) 1,5 ml DMEM/F12-Medium in jede Vertiefung, um abspülen Dispase. Absaugen die DMEM/F12 und fügen Sie 1,5 ml hESC Medium in jede Vertiefung. </li><li> Zu lösen und die Zellen aufzubrechen, legen Sie die Spitze einer 10 ml Glaspipette in Richtung der unteren rechten Ecke eines gut (Berührung der Zellen) und bewegen Sie die Pipette nach oben und unten (vertikal) - die oben stoke sollte in der Nähe sein, dem Verfahren Abwärtsbewegung. Sobald die andere Seite der Wanne erreicht ist, in der horizontalen erzei wiederholenktion. </li><li> Sobald alle Zellen in Suspension sind, legen Sie sie in 15 ml-Tuben und zentrifugieren bei 200 xg für 2 min. Es sollte ein Pellet von Zellen am Boden des Röhrchens sein. Absaugen des Mediums über dem Pellet. </li><li> Die Größe des Zellkulturkolben, die verwendet werden, um die Aggregate in zu halten sollte, hängt von der ursprünglichen Menge der Zellen. Für 6 Vertiefungen (1 Platte) von HES, behandelt ein nicht Gewebekultur T75-Flasche mit 50 ml hESC Medium sollte genutzt werden. Übertragen der Zellen aus Schritt 1.6 in den Kolben und Inkubieren bei 37 ° C. </li><li> Um loszuwerden der Zelltrümmer, sollte das Zellmedium und Kolben etwa 12 Stunden später ersetzt werden. Um dies zu tun, legen Sie alle mittel / Zellen in einer 50 ml Tube, drehen Sie die Zellen nach unten (200 xg für 2 min) und absaugen das alte Medium. Als Nächstes fügen Sie 50 ml frisches hESC Medium zu den Zellen, und in einen neuen T75-Flasche. Die Zellen können dann täglich gemäß demselben Verfahren (bis Tag 5) zugeführt werden. </li></ol><ol><li> Übertragung der Zellen / Medium auf eine 50 ml-Röhrchen, und zentrifugieren die Zellen für 2 min bei 200 x g beträgt. Weiter, absaugen des Überstandes und übertragen die Zellen zu einer neuen (non-Gewebekultur behandelt) T75-Flasche mit 50 ml neuralen Induktion Medium (NIM). </li><li> Sobald die Zellen in NIM sind, sollte die Hälfte des Mediums jeden zweiten Tag ersetzt werden. Die Aggregate sollte groß genug werden, wo sie auf dem Boden eines 50 ml konischen Röhrchen auf eigene nach wenigen Minuten (keine Zentrifugation erforderlich) zu versenken. Nach 2-3 Tagen in NIM (D7-D8 insgesamt), sollten die Zellen bereit sein, auf die Platte. Laminin oder fötalem Rinderserum (FBS) verwendet werden, um zu helfen die Zellen an den Platten zu befestigen. </li><li> Die Anzahl von Gewebekultur behandelten Platten mit 6 Vertiefungen, die benötigt werden, hängt von der Dichte der Zellen, wie jedes Aggregat Lage sein sollten, auf der Platte für mehrere Tage wachsen ohne Berührung eines der anderen. Im Durchschnitt sind die Zellen von einemT75-Kolben erbringt ca. 4-6 6 Well-Platten im Wert von Zellen. </li><li><ol class="ualpha"><li> Bei der Verwendung von Laminin, verdünnen Sie es in NIM auf 10-20 pg / ml zu beschichten die 6-Well-Platte (~ 0,5 ml / well). Nach der Beschichtung für 2-3 Std., Platte Zellaggregate auf 6-Well-Platten (~ 20-30 Aggregate pro Well). Nachdem die Aggregate angeschlossen haben, fügen Sie 1,5 ml der NIM. </li><li> Bei der Verwendung von FBS, bereiten eine Mischung aus 90% NIM und 10% FBS (1,5 ml / well). 1,5 ml Medium mit den Zellen in jede Vertiefung, schütteln die Platte hin und her, um sich auszubreiten die Aggregate, und damit die Zellen O / N in einem Inkubator zu befestigen. Achten Sie darauf, das Medium (2 ml / Vertiefung NIM) ändern am nächsten Morgen die FBS zu entfernen. </li></ol></li><li> Nach einem Tag oder zwei ist vernickelt, wird jedes Aggregat verteilen, um eine Monoschicht bilden. Innerhalb von ein paar Tagen werden die Zentren der meisten dieser Zellen morphologisch ähnlich aussehen Cylinderzellen (längliche). Während dieser Zeit, ändern Sie den NIM jeden zweiten Tag. Einige PSC Linien (besondersly IPSC) können säulenförmige Zellen weniger effizient zu bilden. Wenn dies geschieht, kann die Zugabe von BMP-und TGF-Inhibitoren (Dorsomorphin 29, SB431542 19 bei 2 uM) während Stufe 2 hilfreich sein. </li><li> Rund Tag 14-17, wird die säulenförmigen Zellen erscheinen kompakter. Manchmal sind diese Zellen bilden Stege oder Ringe mit sichtbarem Lumen im Inneren. Neben der säulenartigen Morphologie, exprimieren Zellen in diesem Stadium neuroepithelialen Marker wie PAX6 und SOX1 12,26. </li><li> Bevor die Isolierung beginnen kann, muss man zunächst die Zellen, um zu bestimmen, ob es irgendwelche nicht-Neuroepithelzellen vorhanden sind. Eine objektive Marker kann verwendet werden, um die nicht-neuroepithelialen Kolonien anzuzeigen. Diese können dann durch Kratzen sie mit einem Pipettenspitze beseitigt werden. </li></ol> 3. Generation telencephalen Vorläufer (D17-D24) <ol><li> Die Zentren der Kolonien enthalten Neuroepithelzellen, und sollte aus dem Rest der Kolonie isoliert werden. Dies kann unter Verwendung werdeneiner Mikropipette und eine sterile 1 ml gefiltert Pipettenspitze. Wenn eine kleine Menge an Druck auf den mittleren Abschnitt der Kolonie aufgebracht wird, es in der Regel relativ leicht abhebt. Seien Sie vorsichtig, um sich nicht den äußeren Teil der Kolonie sowie lösen. Wenn die Center agieren stur und wird nicht kommen, sich auf ihre eigenen, können sie durch Herausschneiden sie mit einer Nadel unter dem Mikroskop in einem sterilen Haube entfernt werden. Übertragen Sie die mittleren Abschnitte der Kolonien zu einem 15-ml-Tube und Spin bei 200 xg für 2 min. </li><li> Das Medium sollte aus der Zellen abgesaugt werden. Zwei Platten Wert von Zellen können dann zu einem nicht-Gewebekultur übertragen behandelt T25-Flasche, die 10 ml NIM unter Zusatz von B27 (ohne Vitamin A, 1:50). Verwenden 5-10 ml Medium pro Platte von Zellen. </li><li> Wenn die Zellen angesehen werden am nächsten Tag, sollten sie über eine Sphäre Aussehen. Es ist notwendig, diese Zellen in eine neue Flasche (in Gegenwart von NIM und B27, 1:50) zu übertragen, da sie oft die peripheren Zellendie in schleichen und heften sich an der Unterseite der Flasche. </li><li> Die Neurosphären sollte dann in Suspension für eine Woche mit NIM mit B27 (1:50) ergänzt kultiviert werden. Um Zelle Ausdauer zu fördern und die Proliferation, cyclische AMP (cAMP, 1 pM) sowie Insulin-Wachstumsfaktor (IGF-1, 10 ng / ml) in das Medium während Suspensionskultur zugesetzt werden. An dieser Stelle enthalten die Neurospheres telencephalen Progenitoren (FOXG1 +) und sind bereit, auf Deckgläschen für terminale Differenzierung plattiert werden. </li></ol> 4. Eine weitere Differenzierung in die telencephalen Neuronen (D25 +) <ol><li><ol class="ualpha"><li> Bereiten Sie die poly-ornithine/laminin beschichtete Deckgläser (im 24-Well-Platten) zum Plattieren der Zellen. Deckgläser werden zuerst gereinigt und dann mit Trick-Ornithin beschichtet (mit 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, und in dem Tiefkühler). Poly-Ornithin Beschichtung: <ol><li> Sterilisieren Sie die Deckgläser: Legen Sie die Deckgläser in einerBecherglas mit Salpetersäure und sanft in die Abzugshaube schütteln für eine Stunde. Gießen Sie das Salpetersäure, spülen Sie mehrmals mit DI-Wasser, und lassen Sie die Deckgläser unter fließendem DI-Wasser für mindestens 15 min. Legen Sie die Deckgläschen in 95% Ethanol und entweder für 30 min (bei Verwendung sofort) oder speichern in Ethanol bei RT schütteln. </li><li> In einer sterilen Haube, gieße den Inhalt der 50 ml Tube mit sterilisiert Deckgläser in den Deckel einer 6-Well-Platte. Mit sterilisiert Pinzette, abholen ein Deckglas zu einer Zeit und aufgerichtet in einem Well einer 24-Well-Platte. Wiederholen, so dass jeder auch ein Deckglas hat. </li><li> Nachdem sie vollständig trocknen, tippen Sie auf die Platten bis Deckgläser gefallen Wohnung in jede Vertiefung. Weiter werden 100 ul Poly-Ornithin (0,1 mg / ml in sterilem dH 2 O) zu jedem Deckglas und bebrüten die Platten O / N bei 37 ° C. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen Platten aus dem Inkubator und ihnen erlauben, auf RT abkühlen. Anzusaugen Poly-Ornithin off jedes Deckglas (von der Kante des ter Deckglas) darf dabei nicht berührt oder zerkratzt werden die Deckgläser in den Prozess. Lassen Sie die Deckgläser für ca. 30 min vor dem Waschen zu trocknen. </li><li> 1 ml sterile dH 2 O in jede Vertiefung, lassen Sie sich für 10 min, und saugen das Wasser aus jeder Vertiefung. Wiederholen Sie dies Waschschritt zwei weitere Male. Nachdem die Platten vollständig trocknen, (Urlaub deckt off in der Haube) legen Sie den Deckel auf, mit Alufolie abdecken und bei -20 ° C. </li></ol></li><li><ol><li> Zur Beschichtung der Deckgläser mit Laminin, fügen Sie 50 ul einer Mischung aus neuronalen Differenzierungsmedium und Laminin (Endkonzentration von 20 ug / ml) zu jedem Poly-Ornithin behandelt Deckglas darauf achten, nur die Flüssigkeit berührt das Deckglas selbst (und nicht verschüttet Aus). Inkubieren bei 37 ° C für 1-2 Stunden vor der Herstellung der Zellen zur Befestigung. </li></ol></li></ol></li><li> Sammeln und zentrifugieren Neurosphären bei 200 xg für 2 min in einem 15-ml-Tube. Absaugen des Überstandes. </li> &lt;li&gt; <ol class="ualpha"><li> Spülen Sie die Zellen mit DMEM-F12 und zentrifugieren Sie die Zellen wieder. Wenn die Neurospheres zu groß, um richtig zu befestigen sind, können sie dissoziiert werden mit Accutase bei diesem Schritt. </li><li> Bei Verwendung Accutase: Nach Waschen der Zellen mit DMEM-F12 sind die Neurospheres dissoziiert kleine Cluster durch Zugabe Accutase (~ 2 ml) und Inkubation der Zellen bei 37 ° C für 3 min. Anschließend fügen die gleiche Menge an Trypsininhibitor (~ 2 ml) und die Zellen zentrifugieren bei 200 × g für 3 min. Die Zellen sollten dann in NDM resuspendiert werden und gebrochen Verwendung eines P200 Pipette. Die kleinen Clustern kann dann auf vorbeschichteten Deckgläschen plattiert werden. </li></ol></li><li> Absaugen den Großteil des Mediums und platzieren der Zellen auf einer 6 cm Petrischale in einigen Tropfen des Mediums, so daß sie auswählen wird einfacher. Fügen Sie ca. 4-5 Neurosphären jedem vorbeschichtete Deckglas. Es besteht keine Notwendigkeit, die Laminin absaugen zuerst. </li><li> Lassen Sie die Neurosphären für mindestens 2-4 Stunden zu befestigen. Einmal haben sie einettached gut, sollte mehr Medium (0,5 ml / Deckglas) hinzugefügt werden. Es sollte von neuralen Differenzierungsmedium mit B27 (1:50) ergänzt, cAMP (1 uM) und neurotrophen Faktoren (BDNF, GDNF, und IGF, die alle bei 10 ng / ml) bestehen. An diesem Punkt die Hälfte des Mediums kann jeden zweiten Tag gewechselt werden und diese Zellen können mehrere Monate aufrechterhalten werden. </li></ol>

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E., Richter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+dermal+fibroblasts.">Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).</li><li>Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons.">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li><li>Ebert, A. D., Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient.">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457, 277-280 (2009).</li><li>Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs.">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li><li>Park, I. H., Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li><li>Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+models+of+the+genomic+imprinting+disorders+Angelman+and+Prader-Willi+syndromes.">Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).</li><li>Kiskinis, E., Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+toward+the+clinical+application+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells.">Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells.</a> J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).</li><li>Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1+L166P+mutant+human+pluripotent+stem+cell-derived+neurons+exhibit+partial+loss+of+gamma-secretase+activity+in+endogenous+amyloid-beta+generation.">Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation.</a> Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).</li><li>Walsh, R. M., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Rett+syndrome+with+stem+cells.">Modeling Rett syndrome with stem cells.</a> Cell. 143, 499-500 (2010).</li><li>Egawa, N., Kitaoka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+Screening+for+ALS+Using+Patient-Specific+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Sci. Transl. Med. 4, (2012).</li><li>Kola, I., Landis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+the+pharmaceutical+industry+reduce+attrition+rates.">Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Es gibt mehrere wichtige Schritte während der neuronalen Differenzierung. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die menschlichen pluripotenten PSCs sind, weil ansonsten die Zellen können bereits auf dem Weg zu einem nicht-neuronalen Abstammungslinie vorgespannt werden. Dies kann durch Anfärben der menschlichen PSCs mit Antikörpern gegen Pluripotenz Marker wie Oct4, Sox2, Nanog und Tra-1-60 1-3 bestätigt werden. Wenn die Menschen PSCs nicht sehr gut anbringen müssen nach Passagierung ihnen können ROCK-In...

Menschlichen pluripotenten Stammzellen (PSCs), einschließlich der beiden humanen embryonalen Stammzellen (hES) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS), haben die Fähigkeit, jeden Zelltyp des Körpers, einschließlich Neuronen 1-3 generieren. Gerichteten Differenzierung verschiedener neuronaler Subtypen aus humanen PSCs hält den Schlüssel für die Anwendung dieser Zellen in der regenerativen Medizin. Die Erzeugung von funktionellen neuronalen Subtypen während der Entwicklung ist ein komplexer Prozess, der die Induktion der neuronale Linie, die Spezifikation des regionalen Progenitoren entlang der rostro-kaudalen Achse und die Differenzierung von post-mitotischen Neuronen Typen aus den regionalen Progenitoren 4,5. Beginnend im Jahr 2001 wurden mehrere Systeme eingerichtet, um neuronale Linie von hES-Zellen, die eine Plattform zur Verfügung gestellt haben für die nachfolgende Generation von neuronalen Subtypen 6,7 generieren. Basierend auf Entwicklungsprinzipien, mehrere Neuronen-Typen wie spinalen motorischen Neuronen 8-12, Mittelhirn dopaminerge Neuronen 13-15, und neuronale Zellen der Netzhaut 16,17 wurden effizient von Mensch PSCs angegeben. Dies wurde durch die Anwendung kritischen Morphogene, die wichtig sind für die Spezifikation von diesen Neuronen-Typen während in vivo Entwicklung getan. Andere Protokolle sind auch entwickelt worden, um die Differenzierung zu Neuronen hESCs Verwendung von entweder 18 bis 20 zusätzliche Faktoren wie kleine Moleküle oder durch Co-Kultivierung mit anderen Zelltypen, um Differenzierung fördern 21 fördern. Die menschlichen Neokortex ist hoch entwickelt und enthält viele Zelltypen, einschließlich glutamatergen Neuronen, die eine wichtige Rolle beim Lernen, Gedächtnis und kognitive Funktion 22,23 spielen. Der erste Schritt beim Erzeugen glutamatergen Neuronen in Kultur zu telencephalen Vorläuferzellen angeben. Yoshiki Sasai der Gruppe erstmals über die gerichtete Differenzierung von Vorläufern von Maus telencephalen WSR (mESCs) unter Verwendung eines serumfreien suspension Kultur in Gegenwart DKK1 (was hemmt Wnt-Signalisierung) sowie LeftyA (die Signalisierung hemmt nodalen) 24. Anschließend wurden mehrere Gruppen einschließlich Siemens auch die Spezifikation telencephalen Vorstufen aus menschlichem PSCs in serumfreiem Medium 25-27 berichtet. Die Erzeugung von telencephalen Vorstufen aus menschlichem PSCs erfordert nicht die Verwendung von exogenen Morphogene und die Effizienz bei der Erzeugung dieser Vorstufen ist viel höher als die aus mESCs 26,27. Hier hat sich ein chemisch definiertes System zur Induktion neuronalen die gut an Zhangs Gruppe 7 wurde festgestellt, beschrieben worden. Ohne den Zusatz von exogenen caudalizing Faktoren, dieses Protokoll effizient generiert telencephalen Vorstufen aus menschlichen PSCs 27. Diese Vorläuferzellen können dann in dorsalen oder ventralen Vorläuferzellen durch die Regelung der Signalisierung von Wnt-und Sonic-Hedgehog (SHH) unterschieden werden. Die dorsalen Vorläuferzellen können weiter in glutamatergen Neuronen e unterscheidenfficiently 27. Zusätzlich dieses Protokoll funktioniert auch gut für die Erzeugung von glutamatergen Neuronen aus menschlichem IPSCs 28, die zur Erzeugung von patientenspezifischer Neuronen, die verwendet werden, um den Wirkungsmechanismus sowie mögliche Therapien für eine große Reihe von Krankheiten zu erforschen ueber ermöglicht . Außerdem ist unser System bietet auch eine Plattform für die Entwicklung und Spezifikation der verschiedenen neuronalen Typen im Telencephalon erkunden.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td>Supplier</td>
			<td>Catalog #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non Essential Amino Acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1140-050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (14.3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>116K5103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (human)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L-6274</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17104-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dorsomorphin</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13256-029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES-006-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foxg1 antibody</td>
			<td>Dr. Y. Sasai</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoxb4 antibody (1:50)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>I12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6 antibody (1:5000)</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>PAX6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nkx2.1 antibody (1:200)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB5460</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tbr1 antibody (1:2000)</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB9616</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGLUT1 antibody (1:100)</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>135302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain derived neurotrophic factor (BDNF)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>450-02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glial derived neurotrophic factor (GDNF)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>450-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin growth factor 1 (IGF1)</td>
			<td>PrepoTech Inc.</td>
			<td>100-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic AMP (cAMP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-0260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic hedgehog (SHH)</td>
			<td>R&amp;D</td>
			<td>1845-SH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td>352098</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>352097</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>353047</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T25 flasks (untreated)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks (untreated)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Chemiglass Life Sciences</td>
			<td>1760-012</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>BD</td>
			<td>353004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9'' glass pipetes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-678-20D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip filters (0.22 &mu;M)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup filters 1,000 ml (0.22 &mu;M)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU10RE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phase contrast microscope (Observer A1)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>R2625</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)</td>
			<td>Thermo Electron Corporation</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety hood (Sterilgard III Advance)</td>
			<td>The Baker Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (5702 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells

Hier hat sich ein schrittweises Vorgehen für die effiziente Erzeugung telencephalen glutamatergen Neuronen aus humanen pluripotenten Stammzellen (PSCs) beschrieben worden. Die Unterscheidung wird durch Brechen der menschlichen PSCs zu Klumpen, die sich rund um Aggregate zu bilden, wenn die Zellen in einer Suspensionskultur platziert initiiert. Die Aggregate werden dann in hESC Medium aus den Tagen 1-4 gewachsen für spontane Differenzierung zu ermöglichen. Während dieser Zeit haben die Zellen die Fähigkeit, einem der drei Keimblätter werden. Von Tag 5-8, werden die Zellen in einem neuronalen Induktionsmedium platziert, um sie in das neuronale Linie zu drücken. Um Tag 8 werden die Zellen erlaubt, auf Platten mit 6 Vertiefungen befestigen und differenzieren während welcher Zeit die Neuroepithelzellen Form. Diese Neuroepithelzellen kann am Tag 17 isoliert werden. Die Zellen können dann als Neurosphären gehalten werden, bis sie bereit sind, auf Deckgläser plattiert werden. Verwendung eines basischen Medium ohne Faktoren caudalizing sind Neuroepithelzellen specified in telencephalen Vorstufen, die dann weiter in dorsale telencephalen Progenitoren und glutamatergen Neuronen effizient differenziert werden kann. Insgesamt bietet unserem System ein Werkzeug für die menschliche glutamatergen Neuronen für Forscher erzeugen, um die Entwicklung dieser Neuronen und der Krankheiten, die sie betreffen, zu studieren.

Hier, um ein Protokoll menschlichen PSCs in telencephalen glutamatergen Neuronen differenzieren durch mehrere kritische Schritte: die Bildung von Aggregaten PSC weist die Induktion von Neuroepithelzellen, die Erzeugung von telencephalen Progenitoren und die terminale Differenzierung von Vorläuferzellen in diesen telencephalen Neuronen (Abbildung 1) beschrieben worden. Dieses System ist robust und effizient bei der Erzeugung von telencephalen Progenitoren und glutamatergen Neuronen. Als ein Beispiel <st...

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The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Dieses Verfahren ergibt telencephalen Neuronen durch Durchlaufen Kontrollpunkten, die ähnlich wie beim menschlichen Entwicklung beobachtet werden, sind. Die Zellen werden dürfen spontan zu differenzieren, sind Faktoren, die beide gegenüber der neuronalen Abstammungslinie schieben ausgesetzt, werden isoliert, und werden auf Deckgläschen ausplattiert, um die terminale Differenzierung und Reifung zu ermöglichen.

Die Spezifikation der telencephalen glutamatergen Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

the-specification-telencephalic-glutamatergic-neurons-from-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.8K Aufrufe.  The University of Connecticut Health Center. Dieses Verfahren ergibt telencephalen Neuronen durch Durchlaufen Kontrollpunkten, die ähnlich wie beim menschlichen Entwicklung beobachtet werden, sind. Die Zellen werden dürfen spontan zu differenzieren, sind Faktoren, die beide gegenüber der neuronalen Abstammungslinie schieben ausgesetzt, werden isoliert, und werden auf Deckgläschen ausplattiert, um die terminale Differenzierung und Reifung zu ermöglichen.

Serie: The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Forschung

Neurowissenschaften

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

Ein cGMP-Verfahren zur Erweiterung anwendbar Aggregate von humanen neuralen Stamm-und Vorläuferzellen, abgeleitet von pluripotenten Stammzellen oder fetalen Hirngewebe

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Feeder freie Ableitung von Neural Crest Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily accessible. Through this route, mature neurons can be obtained in a matter of a few weeks. Here, we describe a straightforward and rapid one-step protocol to obtain iNs from dermal fibroblasts obtained through biopsy samples from adult human donors. We explain each step of the process, including the maintenance of the dermal fibroblasts, the freezing procedure to build a stock of the cell line, seeding of the cells for reprogramming, as well as the culture conditions during the conversion process. In addition, we describe the preparation of glass coverslips for electrophysiological recordings, long-term coating conditions, and fluorescence activated cell sorting (FACS). We also illustrate examples of the results to be expected. The protocol described here is easy to perform and can be applied to human fibroblasts derived from human skin biopsies from patients with various different diagnoses and ages. This protocol generates a sufficient amount of iNs which can be used for a wide array of biomedical applications, including disease modeling, drug screening, and target validation.

Direct neuronal reprogramming generates neurons that maintain the age of the starting somatic cell. Here, we describe a single vector-based method to generate induced neurons from dermal fibroblasts obtained from adult human donors.

Einfache Erstellung einer High-Yield-Kultur der induzierten Neuronen aus Menschenhaut Erwachsenen Fibroblasten

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Umwandlung von vom Menschen induktiven Pluripotent-Stammzellen (iPSCs) in funktionale Wirbelsäulen-und Krankheitsanleitungsneuronen mit PiggyBac-Vektoren

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human neurons, which may contribute to neurodegeneration in various disease states. Although it is challenging to examine mitochondrial dynamics in live human nerves, such paradigms are critical for studying the role of mitochondria in neurodegeneration. Described here is a protocol for analyzing mitochondrial transport and mitochondrial morphology in forebrain neuron axons derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). The iPSCs are differentiated into telencephalic glutamatergic neurons using well-established methods. Mitochondria of the neurons are stained with MitoTracker CMXRos, and mitochondrial movement within the axons are captured using a live-cell imaging microscope equipped with an incubator for cell culture. Time-lapse images are analyzed using software with &#34;MultiKymograph&#34;, &#34;Bioformat importer&#34;, and &#34;Macros&#34; plugins. Kymographs of mitochondrial transport are generated, and average mitochondrial velocity in the anterograde and retrograde directions is read from the kymograph. Regarding mitochondrial morphology analysis, mitochondrial length, area, and aspect ratio are obtained using the ImageJ. In summary, this protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology to facilitate studies of neurodegenerative diseases.

Impaired mitochondrial transport and morphology are involved in various neurodegenerative diseases. The presented protocol uses induced pluripotent stem cell-derived forebrain neurons to assess mitochondrial transport and morphology in hereditary spastic paraplegia. This protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology, which will facilitate the study of neurodegenerative disease.

Analyse von mitochondrialem Transport und Morphologie bei humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen bei erblicher spastischer Paraplegie

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

Ableitung, Expansion, Kryokonservierung und Charakterisierung von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns aus humaninduzierten Pluripotenten Stammzellen

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

Generierung humaner Neuronen und Oligodendrozyten aus pluripotenten Stammzellen zur Modellierung von Neuron-Oligodendrozyten-Interaktionen

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...