Mit unserer Technik können wir potenzielle antiepileptische Substanzen in menschlichen Gehirnproben testen, um bei der Arzneimittelentwicklung bei der zeitlichen Lappenepilepsie zu helfen. Das menschliche Hirngewebe hat den Vorteil, dass es die translationale Obergrenze zwischen Grundlagenforschung und klinischen Anwendungen überwindet. Am Tag des Eingriffs oder so spät wie möglich am Vortag 50 Milliliter einer 10x Cholin-aCSF-Lösung in einem 37 Grad Celsius Wasserbad auftauen und die aufgetaute Lösung und 50 Milliliter 10x Lösung zwei bis etwa 300 Milliliter doppeldestilliertes Wasser hinzufügen.
Die Endkonzentrationen von Glukose und Calciumchlorid in das Gemisch geben und rühren, bis es gelöst ist. Dann doppeldestilliertes Wasser zu einem Endvolumen von 500 Millilitern hinzufügen. Messen Sie die Osmolarität.
Und füllen Sie eine Flasche mit ca. 100 Milliliter des 1x Cholin aCSF. Am Tag des Eingriffs kühlen Sie das 1x Cholin aCSF auf Eis und verwenden Sie einen Glasgasspender, der mit Carbogen-Gas verbunden ist, um die Lösung für mindestens 10 bis 15 Minuten zu karben. Mindestens 10 bis 15 Minuten vor dem Eingriff die Lagerung aCSF, hohe Kalium plus 4-Aminopyridin aCSF und niedriges Magnesium plus Bickululin auf 35 Grad Celsius mit Karbogenation vorwärmen.
Zur Vorbereitung der Schnittstellenkammer zwei vier mal zwei Zentimeter Filterpapier für jedes Scheibenhaltefach schneiden und die Teile übereinander stapeln. Legen Sie dann dünne Baumwollsaiten um die Filterpapiere in die Fächer, um die Spannung der Lösung zu brechen und einen gleichmäßigen Fluss zu gewährleisten. Und legen Sie drei bis vier 1,5 mal 1 Zentimeter Filterpapier auf das größere Stück Filterpapier in jedem Fach.
Vor dem Erwerb der Gewebescheiben verwenden Sie 70% Ethanol, um den Vorbereitungsbereich abzuwischen und eine Abdeckung über den Bereich zu legen. Legen Sie Superkleber, zwei scharfe Pinzette, einen Spachtel, ein Skalpell mit Klingen und eine Klinge für grobes Schneiden des Gehirngewebes in der Nähe des Vibratom. Wischen Sie die Pufferschale und die Probenplatte des Vibratom mit 70% Ethanol ab.
Wenn die Pufferschale vollständig trocken ist, bedecken Sie sie mit Aluminiumfolie und legen Sie das Tablett in das Eisbad. Füllen Sie das Eisbad mit zerkleinertem Eis und halten Sie das Bad bei minus 20 Grad Celsius bis zur Vorbereitung. Wischen Sie dann das Vibratom und die Rasierklinge mit 70 % Ethanol ab und kalibrieren Sie das Vibratom, um vertikale Vibrationen und Gewebeschäden während des Schneidvorgangs zu minimieren.
Unmittelbar nach dem Erwerb der Gewebeprobe, entfernen Sie das Gewebe aus dem Transport Cholin aCSF und schneiden Sie alle verbrannten Teile des Gewebes. Schneiden Sie eine gleichmäßige Oberfläche, um das Verkleben des Gewebestücks auf die Probenplatte zu erleichtern, und verwenden Sie das Vibramme, um das Hirngewebe in 400 Mikrometer dicke Scheiben zu schneiden, wodurch die Amplitude und Geschwindigkeit des Vibratome während des Schneidens nach Bedarf angepasst wird. Einige Teile des menschlichen Hippocampus können resistenter gegen Schneiden als andere sein.
Zusätzliche Sorgfalt und Zeit können die Probenqualität erheblich verbessern. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Gehirnscheiben zu trimmen, um in die Aufnahmekammer zu passen und verwenden Sie einen Spachtel und kleine Zangen, um die Scheiben vorsichtig auf die kleinen Stücke Filterpapier in der Schnittstellenkammer für mindestens eine Stunde zu legen. Zur epileptischen Aktivitätsaufzeichnung eine halbdurchlässige Membran, die an einen Kunststoffring geklebt ist, in die Kammer zu legen und die Zu- und Abflussrohre der Kammer mit einer peristaltischen Pumpe zu verbinden.
Füllen Sie die Rohre und die Kammer mit vorgewärmten Karbogenat aCSF. Zur Vorbereitung der Aufnahmeelektroden ein bis zwei Megaohm-Glaspipetten mit 154 Millimolar-Natriumchloridlösung füllen. Legen Sie die Pipetten in einen Elektrodenhalter und verwenden Sie eine Pinzette und einen Spachtel, um eine Hippocampusscheibe aus der Grenzflächenkammer in eine Petrischale zu übertragen, die mit kariertem aCSF gefüllt ist.
Entfernen Sie das Filterpapier, ohne die Scheibe umzudrehen, und legen Sie die Scheibe in die Aufnahmekammer. Halten Sie die Scheibe mit Scheibengitter an Ort und Stelle und legen Sie die Elektroden in den Bereich des Interesses. Beginnen Sie die Aufzeichnung.
Die durch das hohe Kalium plus 4-Aminopyridin induzierte Burstaktivität sollte zwei bis fünf Minuten nach dem Einwaschen sichtbar sein, während die Induktion von anfallsähnlichen Ereignissen durch niedriges Magnesium plus Bicululin bis zu 30 Minuten dauern kann. Die Anwendung von hohem Kalium plus 4-Aminopyridin induziert epileptiforme Aktivität in Form von Burst-Ereignissen innerhalb weniger Minuten. Krampfanfall-ähnliche Ereignisse mit einer Dauer von über 10 Sekunden können mit der Anwendung von niedrigem Magnesium plus Bickululin induziert werden.
Die Anzahl der Burst-Ereignisse nimmt sowohl während der Anwendung von Lacosamide als auch bei der Anwendung von Dimethylethanolamin ab, obwohl die Amplituden meist nicht betroffen sind. Die Qualität des Hirngewebes kann auch durch die Verringerung der Kontamination und Schäden während der Vorbereitung verbessert werden. Mit unseren Methoden hergestellte Menschliche Gehirnscheiben können auch verwendet werden, um grundlegende physiologische Funktionen von Neuronen mit Patch-Klemme zu untersuchen oder die Genexpression mit verschiedenen Techniken zu untersuchen.
Labore auf der ganzen Welt haben begonnen, grundlegende Mechanismen innerhalb des menschlichen Gehirns zu studieren, und diese Erkenntnisse können verwendet werden, um bei der Entwicklung von Medikamenten zu helfen und können mit unseren vorgeschlagenen Methoden getestet werden.
