Krebszellen haben eine bemerkenswerte Fähigkeit, Nährstoffe wie ATP aus der extrazellulären Umgebung zu internalisieren. Unser Protokoll ermöglicht es uns, die ATP-Internalisierung zu demonstrieren und die ATP-Lokalisierung in Zellen zu visualisieren. Diese hochauflösende Bildgebung von internalisiertem ATP innerhalb von Makropynozoomen ist ideal, um die spezielle Lokalisierung zu verstehen und die Menge der Analyse der Internalisierung abzuschließen.
Das Protokoll beschreibt verschiedene experimentelle Anwendungen zur Untersuchung der ATP-Internalisierung. Diese Methode kann verwendet werden, um verschiedene Mechanismen der zellulären Internalisierung zu untersuchen, einschließlich Makropinozytose und Exosomen-vermittelter Endozytose. Bei Stoffwechselerkrankungen kann die ATP-Internalisierung in Nicht-Krebszellen mit diesem Protokoll untersucht werden.
Um zu beginnen, säen Sie die Krebszellen in einen 225-Quadratzentimeter-Kolben, der DMEM enthält, ergänzt mit FBS und Antibiotika. Lassen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid im Zellkultur-Inkubator wachsen. Sobald der 80% Konfluenz erreicht ist, lösen Sie die Zellen und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation ab und resuspendieren Sie die Zellen in eiskaltem PBS, um die Zelldichte von 5 mal 10 zu den 6 Zellen pro 100 Mikroliter PBS zu erreichen.
Die Zellsuspension wird in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Reinigen Sie die Injektionsstelle an der Flanke einer immundefizienten Maus mit 75% Ethanol und wischen Sie überschüssiges Ethanol mit einem feinen Task-Wipe ab. Ziehen Sie die Zellen in eine latexfreie Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Präzisionsgleitnadel ausgestattet ist.
Halten Sie für die subkutane Injektion die Nadel in einem Winkel von etwa 10 Grad zur Haut und führen Sie die Nadelspitze mit der Fase nach oben unter die Haut ein, wobei nur ein bis zwei Millimeter der Nadel außerhalb der Haut bleiben. Geben Sie die Zellen langsam über ca. 10 Sekunden aus der Spritze ab. Nachdem Sie das gesamte Volumen injiziert haben, halten Sie die Nadel für drei bis fünf Sekunden an Ort und Stelle und ziehen Sie dann die Nadel zurück.
Üben Sie mit den Fingern einen sanften, aber festen Druck auf die Injektionsstelle aus, um ein Austreten des injizierten Inhalts zu verhindern. Überwachen und messen Sie das Tumorwachstum mit Vernier-Messschiebern, bis die Tumore ein Volumen von 200 bis 500 Kubikmillimetern erreichen. Lösen Sie 300 Mikroliter von 16 Milligramm pro Milliliter hochmolekulares fluoreszierendes Dextran und serumfreies DMEM auf und inkubieren Sie in einem Wasserbad, temperiert bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten, dann zentrifugieren Sie die Dextranlösung und übertragen Sie den Überstand in ein neues 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen.
Bei 40 Mikrolitern wird ein ein Millimol großes, nicht hydrolysierbares fluoreszierbares ATP-Analogmaterial zu 160 Mikrolitern serumfreiem DMEM hergestellt, um eine 0,2 Millimol große, nicht hydrolysierbare fluoreszierbare ATP-Lösung herzustellen. Herstellung der Behandlungslösungen von DMEM oder acht Milligramm pro Milliliter hoch- oder niedermolekularem fluoreszierendem Dextran, mit oder ohne 100 mikromolare nichthydrolysierbare Fluoreszenz-ATP in DMEM, durch Mischen der zuvor hergestellten Stammlösungen. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, um 50 Mikroliter einer Behandlungslösung zu sammeln.
Injizieren Sie die Lösung direkt in den Xenotransplantattumor und wiederholen Sie sie für vier biologische Replikate jeder Behandlung. Nachdem Sie die Maus eingeschläfert und das Tumorgewebe isoliert haben, verwenden Sie einen perforierten Löffel, um das resezierte Tumorgewebe aufzusaugen und das Gewebe sofort in ein gefrierendes Medium zu legen und das Gewebe zu rollen, um sicherzustellen, dass das Gewebe in den mittleren Bädern, allen Gewebeoberflächen, eingetaucht bleibt. Legen Sie das Gewebe vorsichtig in die Einbettform, die das Gefriermedium enthält.
Platzieren Sie das entsprechende Etikettenetikett vertikal in das Gefriermedium oder die Form, um sicherzustellen, dass das geschriebene Etikett außerhalb des Mediums sichtbar ist. Wenn das Gefriermedium undurchsichtig weiß wird, entfernen Sie den Gewebeblock aus der Form, legen Sie den Gewebeblock auf Trockeneis und wiederholen Sie das Einfrieren für jeden Tumorabschnitt. Lagern Sie die Gewebeblöcke bei minus 80 Grad Celsius für mehrere Monate vor dem Kryosektionsvorgang.
Nachdem Sie die Objektträger der Gewebeblöcke hergestellt haben, fixieren Sie die Gewebeschnittobjektträger fünf Minuten lang in 95% Ethanol bei minus 18 Grad Celsius. Waschen Sie den festen Abschnitt fünf Minuten lang mit PBS. Fügen Sie 10 bis 50 Mikroliter eines wässrigen Montagemediums mit DAPI zu den Gewebeschnitten hinzu, je nach Größe der Abschnitte, und legen Sie einen Glasabdeckungsrutsch über den Gewebeabschnitt.
Identifizieren Sie nach 12 bis 24 Stunden der Montage interessante Regionen der festen Tumorabschnitte und erfassen Sie die Bilder mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie, wie zuvor gezeigt. Nach zwei bis 24 Stunden der Fixierung der menschlichen Tumorzellen und dem Stehen mit DAPI erfassen Sie die Bilder mit einem Epifluoreszenz-Bildgebungssystem und einer Datenerfassungssoftware. Legen Sie den Objektträger im binokularen Modus auf die Bühne eines aufrechten Epifloreszenzmikroskops.
Öffnen Sie das Bildgebungsprogramm, wählen Sie das 10-fache Objektiv aus und passen Sie die Bühne an, um den Fokus zu definieren. Scannen Sie das Dia von links nach rechts in serpentinenförmiger Weise, um die interessierenden Regionen zu identifizieren. Wählen Sie das 40-fache Objektiv aus und wechseln Sie mit dem Schalter am Mikroskop vom Binokular- in den Bilderfassungsmodus.
Klicken Sie auf das Live-Qualitätssymbol, um die Bilder anzuzeigen und anschließend zu erfassen. Verwenden Sie das OC-Bedienfeld auf der Erfassungssymbolleiste, um die Belichtungsparameter für jeden Filterwürfel oder Fluoreszenzkanal zu definieren, und verwenden Sie dann die Symbolleiste für die Mehrkanalerfassung, um ein Dreikanalbild mit den definierten Belichtungseinstellungen zu erfassen. Alternativ können Mehrkanalbilder manuell aufgenommen werden, indem zwischen den Filterwürfeln umgeschaltet, die Belichtungszeit eingestellt, der Verschluss zwischen der Bildaufnahme für jeden Kanal geschlossen oder geöffnet und jedes für einzelne Kanäle aufgenommene Bild überlagert wird.
Speichern Sie das Bild als nd2-Datei. Speichern Sie die TIF-Dateien, einschließlich des zusammengeführten Kanalbilds und einzelner Kanalbilder. Verwenden Sie die Objektzählungsfunktion auf der Symbolleiste für Anmerkungen und Messungen, um die Anzahl der NHF-ATP-, TMR hochmolekularen fluoreszierenden Dextran- und TMR niedermolekularen fluoreszierenden Dextran-positiven Zellen in einer gespeicherten nd2-Bilddatei zu zählen und die Daten über das Analyseprogramm in eine Tabelle zu exportieren.
Dieses Protokoll wurde für die räumliche, zeitliche und quantitative Analyse der zellulären Internalisierung von nicht hydrolysierbarem ATP entwickelt. Die intrazelluläre Internalisierung von nicht hydrolysierbarem fluoreszierendem ATP wurde durch Kolokalisierung von nicht hydrolysierbarem fluoreszierendem ATP mit hoch- oder niedermolekularem fluoreszierendem Dextran in vitro, ex vivo und in vivo nachgewiesen. Um sicherzustellen, dass Tumorzellen verinnerlichtes ATP beibehalten, begrenzte experimentelle Zeit für alle intratumoralen Injektionen zur Kryo-Einbettung.
Berücksichtigen Sie auch die intratumorale Variation, indem Sie Gewebe im gesamten Tumor abbilden. Zukünftige Iterationen unserer Methode könnten eine Echtzeit-Visualisierung des E-ATP-Internalisierungsprozesses beinhalten, Informationen über die makropynozytotische Kinetik und den Transport in bestimmten Geweben aufdecken.
