Dieses Verfahren adressierte den Bedarf an einer einfachen und zuverlässigen Sammlung von aus mesenchymalen Stammzellen gewonnenen extrazellulären Vesikeln und der Anwendung in der Translation von Forschung. Die Sammlung extrazellulärer Vesikel durch differentielle Zentrifugation ist einfach, leicht skalierbar und reproduzierbar, was für das Feld nützlich sein wird. Extrazelluläre Vesikel ununterscheidbar}von undeutlichen}mesenchymalen Stammzellen ist eine ununterscheidbare}Anwendung in der modernen Krankheitsbehandlung.
Ich werde keine Angst vor Fehlern haben. Diese Bedienung ist einfach und leicht zu erlernen. Es gibt viele Details in diesem einfachen Programm, die besser durch Video dargestellt werden können.
Kultivieren Sie zunächst die mesenchymalen Stammzellen zu mehr als 90 % Konfluenz. Ersetzen Sie das Nährmedium in jeder Schale durch 8 ml zugesetztes alpha-MEM. Nach 48 Stunden Kultur müssen die Zellen gleichmäßig gezüchtet werden, um das Nährmedium vollständig in 50-ml-Zentrifugenröhrchen zu sammeln.
Anschließend zentrifugieren Sie das Nährmedium bei 800 x g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand in konische 1,5-ml-Röhrchen, um die Zellfragmente und Zelltrümmer zu entfernen. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 16.000 x g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.
Verwenden Sie eine Pipette, um die Suspension in Ultrazentrifugenröhrchen zu übertragen. Anschließend bei 150.000 x g für zwei Stunden bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Mikrovesikelpellet in 50 μl PBS pro Schale.
Verwerfen Sie den Überstand und sammeln Sie den Rest, bei dem es sich um Exosomen handelt. Resuspendieren Sie die Exosomen aus sieben Zellschalen in 50 μl PBS. In einem 15-ml-Röhrchen 1 μl extrazelluläre Vesikel in 1,499 μl PBS verdünnen und mischen.
Starten Sie dann die kompatible Software für den Tracking-Analysator. Füllen Sie die Probenzelle mit destilliertem Wasser und lassen Sie das Gerät dann mit der Zellprüfung beginnen. Kalibrieren Sie das Gerät mit einer vorbereiteten Standardlösung.
Stellen Sie sicher, dass die auf der Software-Erkennungsschnittstelle angezeigte Partikelanzahl zwischen 50 und 400, vorzugsweise etwa 200, liegt, und klicken Sie auf OK. Spülen Sie anschließend die Probenzelle mit 5 ml destilliertem Wasser aus. Spülen Sie den Kanal vor der Probenanalyse mit 1 ml destilliertem Wasser.
Stellen Sie sicher, dass die auf der Software-Erkennungsschnittstelle angezeigte Partikelanzahl kleiner als 10 ist. In einem konischen 1,5-ml-Röhrchen werden die extrazellulären Vesikel mit 250 μl PBS resuspendiert. In einem weiteren konischen 1,5-ml-Röhrchen wird die Arbeitslösung des PKH26-Farbstoffs hergestellt.
Mischen Sie die resuspendierten extrazellulären Vesikel mit der Arbeitslösung. Lassen Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur stehen und fügen Sie dann 500 μl EV-abgereichertes FBS hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Bei Mikrovesikeln bei 16.000 x g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.
Verwerfen Sie den Überstand. Fügen Sie 1 ml PBS hinzu, um die Rückstände zu spülen. Zentrifugieren Sie erneut und entsorgen Sie den Überstand, um den ungebundenen Farbstoff zu entfernen.
Bei Mikrovesikeln bei 16.000 x g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Resuspendieren Sie den Rückstand mit 200 μl PBS. Geben Sie 20 μl Suspension auf den Objektträger und beobachten Sie ihn unter einem Fluoreszenzmikroskop.
Extrazelluläre Vesikel in 200 μl PBS resuspendieren und dann mit Heparinlösung in einem Volumenverhältnis von 10:1 mischen. Setzen Sie die Maus in das Bildgebungssystem der Schwanzvene ein. Drücken Sie den Schalter, um den Hebel anzuheben.
Führen Sie mit Hilfe eines Schwanzvenenillustrators eine systematische Injektion der extrazellulären Vesikelsuspension durch die Schwanzvene durch. Die Analyse der Partikelgrößenverteilung mittels NTA zeigte, dass die Größe der Exosomen aus humanen mesenchymalen Stammzellen zwischen 40 und 335 nm lag, mit einer Peakgröße von etwa 100 nm. Auch die Größe der Mikrovesikel reichte von 50 bis 445 nm, mit einer Peakgröße von 150 nm.
Die morphologische Charakterisierung der Exosomen zeigte, dass sie eine typische Becherform aufwiesen. Extrazelluläre Vesikel wurden effizient durch PKH26 markiert, was sowohl in der groben Ansicht als markierte Pellets als auch durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden konnte. Der Bediener sollte bei der Entnahme des Überstands aufpassen, da die Zellen gleichmäßig geblasen werden müssen, um die freigesetzten EVs, die in den undeutlichen mesenchymalen Stammzellen zurückgehalten werden, vollständig zu sammeln.
Um den Erfolg der Injektion zu verifizieren, kann eine In-vivo-Bildgebung der Bioverteilung von fluoreszenzmarkierten EVs oder gefrorenen Schnitten bestimmter Gewebestellen durchgeführt werden.
