Die Visualisierung der Aufnahme kleiner extrazellulärer Vesikel, auch bekannt als sEVs, durch verschiedene Zellen im Rückenmark kann eine erfolgreiche Abgabe von sEVs bestätigen. Dies ermöglicht sowohl mechanistische als auch therapeutische Untersuchungen von intrathekal verabreichten sEVs aus verschiedenen Quellen in Nagetiermodellen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Aufnahme von sEVs durch Zellen in einem milden Rückenmark zu visualisieren, und kann helfen, die Rolle von sEVs und ihren Ladungsmolekülen bei Wirbelsäulenerkrankungen, Schmerzen und Entzündungen zu bewerten.
Dieses Verfahren wird von mir zusammen mit Xuan Luo a nd Zhucheng Lin, den beiden Doktoranden im Labor von Dr. Seena Ajit, demonstriert. Beginnen Sie, indem Sie 18 Millimeter Abdeckungsrutsche in die 12-Well-Platte legen, dann Platten-Neuro-2a-Zellen in jeder Vertiefung mit insgesamt 1 Milliliter vollständigem DMEM mit 10% FBS und 1% Stiftstreusel. Wenn die Zellzahlgewandtheit 80 bis 90% erreicht hat, ändern Sie das Medium zu DMEM Exosome erschöpftem Medium in jeder Vertiefung fügen Sie ein, 5 oder 10 Mikrogramm markierte sEVs hinzu.
Für 1, 4 und 24 Stunden. Für dosis- und zeitabhängige Aufnahme in den Rest der Vertiefungen bei gleichem Volumen der Farbstoffkontrolle. Sammeln Sie die Gehirne postnataler Welpen in einer 60 Millimeter großen Petrischale mit eiskalter Hanks-ausgewogener Salzlösung, ergänzt mit 10 millimollaren Hepes, sezieren Sie beide kortikalen Lappen und entfernen Sie die Hirnhäute.
Dann hacken Sie das Gewebe mit einer sterilisierten Klinge. Das Gewebe wird in ein 15-Milliliter-Konusröhrchen mit Pepan oder Desoxyribonukleus, einem Dissoziationspuffer, inkubiert und 20 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert, das Röhrchen alle 5 Minuten verwirbelt, den Überstand absaugen und 5 Milliliter vollständiges DMEM in das Röhrchen geben. Um die Enzymaktivität zu inaktivieren, versuchen Sie, die Gewebe sorgfältig mit einer 5 Milliliter Glaspersatz pipette und einer flammenpolierten Weidepipette zu dissoziieren.
Führen Sie die Zellsuspension durch ein 40 Mikrometer großes Zellsieb und zentrifugieren Sie die Zellen dann bei 250 mal G für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius, saugen Sie das Medium an und sehen Sie die Zellen in 10 Millilitern vollständigem DMEM in einem 75-Quadratzentimeter-Kolben. Ersetzen Sie nach 4 Stunden Beschichtung das Supernat und das Medium durch 15 Milliliter frisches DMEM-Medium. Nach 14 Tagen in vitro, um die Mikroglia und Oligodendrozyten zu lösen, den Kolben für 6 Stunden bei 320 U / min in einen Orbitalschüttler überführen.
Verwenden Sie 5 Milliliter des Zelldissoziationsenzyms für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius. Um zu tripsinisieren, fügen die verbleibenden Astrozyten, um die enzymatische Wirkung zu inaktivieren, fügen Sie 5 Milliliter vollständiges DMEM hinzu und pelletieren Sie dann die Zellen bei 250 mal G für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Zellen in vollständigem DMEM und sehen Sie, wie die Zellen auf der 12 Millimeter Zahl 1,5 Abdeckung in eine 24 Well Platte schlüpfen.
Mit PBS die Zellen 3 mal ausspülen und dann mit 4% Power Formaldehyd oder PFA in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Waschen Sie die festen Zellen 3 Mal für 5 Minuten mit PBS und permeabilisieren Sie sie mit 0,1% Triton X 100 in PBS für 10 bis 15 Minuten. Wiederholen Sie dann die Waschungen mit PBS.
Verwenden Sie 5% normales Ziegenserum oder NGS in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur, um die Zellen zu blockieren, inkubieren Sie die Neuro-2a-Zellen mit Map-Zwei-Wege-Antikörpern und die primären Astrozyten mit GFAP-Antikörpern in einem Verhältnis von 1 zu 500 in frischem 5% NGS oder PBS über Nacht bei 4 Grad Celsius mit sanftem Schütteln. Nachdem Sie die Zellen 3 Mal in PBS gewaschen haben, fügen Sie die Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in 5% NGS hinzu. 2 Stunden bei Raumtemperatur vor Licht geschützt auf einer Wippe inkubieren.
Wiederholen Sie das Waschen mit PBS und inkubieren Sie die Zelle mit 1 Mikrogramm pro Milliliter DAPI für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen erneut 3 Mal mit PBS. Montieren Sie mit einem Anti-Fade-Montagemedium die Cover-Slips auf Dias Nummer 1, lassen Sie sie über Nacht im Dunkeln trocknen und lagern Sie die vorbereiteten Glasobjektträger bei 4 Grad Celsius bis zur Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop.
Sezieren Sie das Rückenmark und fixieren Sie es in 4% PFA in PBS bei 4 Grad Celsius für 24 Stunden. Schützen Sie die Gewebe in 30% Saccharose in PBS bei 4 Grad Celsius für 24 Stunden oder bis das Gewebe sinkt und lagern Sie das Gewebe dann bei 4 Grad Celsius bis zur Immunhistochemie, immmieren Sie das L4 L5 Rückenmark in OCT-Verbindung, dann frieren Sie es auf Trockeneis ein, bis es vollständig erstarrt ist. Verwenden Sie einen Kryostaten, um das Gewebe in 30 Mikrometern zu durchtrappen, und sammeln Sie die Abschnitte in einer 24-Well-Platte, die PBS enthält.
Waschen Sie die Abschnitte 3 mal für jeweils 5 Minuten mit 0,3% Triton in PBS, blockieren Sie die unspezifischen Bindungsstellen mit 5% MGS in 0,3% Triton PBS für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Abschnitte über Nacht bei 4 Grad Celsius auf einem Shaker. Waschen Sie die Abschnitte 3 mal für 5 Minuten mit 0,3% Triton in Pbs.
Fügen Sie dann die entsprechende Konzentration der sekundären Antikörper hinzu. Laut Textmanuskript zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, die Abschnitte nur mit PBS waschen und inkubieren Sie sie in 1 Mikrogramm pro Milliliter DAPI für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie dann die PBS-Wäschen unter einem Lichtmikroskop, montieren Sie die Abschnitte auf einem klaren Klebeobjektträger mit einem feinen Pinsel.
Befeuchten Sie den Deckzettel mit dem Montagemedium und härten Sie über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur aus, nehmen Sie Bilder unter einem konfokalen Mikroskop mit den jeweiligen Lasern auf, Die durchschnittliche mittlere Größe von RA 2 6 4 0,7 abgeleiteten sEVs betrug 140 Nanometer und die Spitzenpartikelgröße betrug 121,8 Nanometer. Mit den am besten nachweisbaren Partikeln, die in den Größenbereich von Exosomen oder sEVS fallen. Bei 50 bis 150 Nanometern zeigte das Western Blotting von sEVs, Zelllysat und exodepleted Media, dass sEV-abgeleitete Proteinproben die sEV-Markerproteine Alix CD81 und GAPDH enthielten.
Das Zelllysat wurde mit endoplasmatischem Retikulum angereichert, dem residenten Protein Calnexin, so dass Calnexin als negativer Marker für zelluläre Kontamination diente, da es in den sEVs fehlte. Es wurde beobachtet, dass die Aufnahme von sEVs nach 1 Stunde erfolgte und für die 1, 5 und 10 Mikrogramm sEVs die Fluoreszenz nach der Inkubation nach 4 Stunden für 4, 5 und 10 Mikrogramm sEVs nachgewiesen werden konnte. Die Aufnahme von PKH 26-markierten sEVs durch primäre Astrozyten wurde untersucht und die maximale Fluoreszenz aus der sEVS-Aufnahme in primären kortikalen Astrozyten trat nach 24 Stunden auf PKH26-markierte sEVs wurden aufgenommen und maximale Fluoreszenz wurde nach 6 Stunden beobachtet, nach der Injektion in Neuronen Astrozyten und Mikrogliazellen.
Die Einbeziehung von Steuerelementen, unbeschrifteten sEVs und Farbstoffkontrolle erzeugt Code zu einem Wind falsch positive jüngste Signale aufgrund der jetzt spezifischen Kennzeichnung Opry Tanz von Ungebundenen Farbstoff-Patch-Küsten. Die Aufnahme von seVs kann durch die Untersuchung des biomolekularen Frachttransfers auf Rezeptur und Zellen und Gewebe und die Bestimmung der Veränderungen der Expressionsniveaus von Biomolekülen oder Zielgenen bestätigt werden. Verhaltensstudien können auch durchgeführt werden, um die funktionellen Auswirkungen der sEV-Lieferung zu untersuchen.
