Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und schnelle Methode zur Messung der mitochondrialen Funktion des Tumors. Das Protokoll ist weitgehend auf die klinische translationale Onkologie anwendbar und wird dazu beitragen, die diagnostische und mechanistische Interpretation der Rolle der Mitochondrien bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs zu verbessern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Anwendung der Gewebehomogenisierung, um die Vorbereitung zu vereinfachen und die Ausbeute der Mitochondrien zu maximieren und gleichzeitig die Einschränkungen der Diffusion zu mildern.
Diese Technik bietet potenzielle Anwendungen in klinischen und diagnostischen Umgebungen mit einer quantitativen Bewertung der mitochondrialen Funktion des Tumors unter Verwendung von frisch biopsiertem oder ausgeschnittenem Tumorgewebe. Beginnen Sie damit, einen Glashomogenisator, der einen Milliliter mitochondriales Atmungsmedium oder MiR05 enthält, in einen eng anliegenden Glasstößel auf Nasseis zu legen. Legen Sie das Gewebe in einen Milliliter Biopsiekonservierungslösung (BIOPS) in eine eiskalte Petrischale.
Schneiden Sie den Tumor in kleine Stücke von jeweils etwa 5 bis 10 Milligramm und legen Sie die verbleibenden Tumorstücke wieder in 10 Milliliter BIOPS, die auf Eis aufbewahrt werden. Nachdem Sie die Gewebeabschnitte vorsichtig auf ein Filterpapier getupft haben, legen Sie sie auf ein kleines, mit Kunststoff geteertes Wiegeboot und notieren Sie das anfängliche Nassgewicht. Legen Sie die unbenutzten Stücke zur weiteren Konservierung wieder in das konische 10-Milliliter-Röhrchen von BIOPS.
Tauchen Sie die Gewebeabschnitte in einen eiskalten Homogenisator, der MiR05 enthält, und notieren Sie das verbleibende Gewicht auf dem Wiegeboot. Mit einem Glasstößel mit einem Freiraumbereich von 0,09 bis 0,16 Millimetern wird das Tumorgewebe vorsichtig gestört, indem fünf bis sieben Schläge nach unten und oben durchgeführt werden. Drehen Sie den Stößel für jeden Schlag dreimal im Uhrzeigersinn / gegen den Uhrzeigersinn, während Sie den Stößel nach unten drücken, und drei weitere Male, während Sie den Stößel wieder nach oben ziehen.
Lassen Sie das Gewebe sich zwischen den Schlägen am Boden des Homogenisators absetzen, aber vermeiden Sie es, den Stößel vollständig über das Flüssigkeitsvolumen zu bringen, um ein Aufschäumen zu verhindern. Gießen Sie das Homogenat in ein konisches 15-Milliliter-Rohr und legen Sie es auf Eis. Ein bis drei Milliliter frisches MiR05 über den Stößel und in den Homogenisator pipettieren, um das verbleibende Gewebehomogenat zu waschen.
Gießen Sie die MiR05-Wäsche in das konische Röhrchen, das das Homogenat enthält. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei- bis dreimal, um eine vollständige Übertragung des Homogenats sicherzustellen. Um die Gewebehomogenatkonzentration genau zu berechnen, untersuchen Sie den Homogenisator und das Homogenat sorgfältig auf verbleibendes nicht homogenisiertes Material, zu dem auch Bindegewebe gehört.
Um das nicht homogenisierte Material aus dem Homogenisator zu entfernen, das mit einer Pinzette nicht erreicht werden kann, saugen Sie nach Zugabe von MiR05 zum Homogenisator das Volumen, einschließlich des Gewebes, mit einer Pipette ab und bewegen Sie den Inhalt in eine Petrischale. Entfernen Sie das nicht homogenisierte Material, das sich in großen Stücken am Boden des konischen Rohres abgesetzt hat, aus dem Homogenat, indem Sie es mit einer Pipette ansaugen, und legen Sie es auf die Kappe des konischen Rohrs. Entfernen Sie das Gewebe mit einer Pinzette aus der Petrischale oder der konischen Röhrchenkappe und tupfen Sie es auf Filterpapier.
Das restliche Homogenat aus der konischen Rohrkappe wieder in das konische Rohr geben. Kappen Sie das Röhrchen und kehren Sie es dann um, um es zu mischen. Überprüfen Sie die Homogenisatoren erneut und homogenisieren Sie auf zusätzliches nicht homogenisiertes Material, und wiederholen Sie bei Bedarf die Schritte zum Entfernen von nicht homogenisiertem Material.
Wiegen und notieren Sie die Masse des aus dem Homogenisator gewonnenen nicht homogenisierten Materials. Untersuchen Sie die Homogenataufbereitung auf grob intaktes Übertragenes Gewebe, entfernen Sie die nicht homogenisierten Stücke und wiegen Sie sie bei Bedarf. Subtrahieren Sie das Gewebegewicht, das vom Wiegeboot, homogenisator und homogenisiert wird, vom anfänglichen Nassgewicht, um das endgültige Probengewicht zu berechnen.
Fügen Sie unter Verwendung des endgültigen Probengewichts zusätzliches MiR05 hinzu, um homogenat auf die gewünschte Konzentration zu bringen. Sobald das Homogenat gewogen und vorbereitet ist, fahren Sie so schnell wie möglich mit der Untersuchung fort. Bewahren Sie die Probe auf Nassemis auf, bis sie auf das Instrument übertragen wird.
Sobald das Instrument kalibriert und die Probe vorbereitet ist, entfernen Sie die Stopfen mit einer Drehbewegung und aspirieren Sie den MiR05 aus den Kammern, wobei Die Membran in der Kammer freigelegt wird. Mischen Sie das Homogenat gut und geben Sie 2,25 Milliliter des Homogenats in die Kammer. Angenommen, ein Homogenat wird mehreren Kammern zugesetzt, pipettieren Sie jeweils einen Milliliter des Homogenats in jede Kammer, während Sie das Homogenat mischen, um eine gleichmäßige Gewebeverteilung zu gewährleisten.
Klicken Sie auf F4, um das Ereignis zu benennen und mit einem Zeitstempel zu versehen, und klicken Sie dann auf OK. Füllen Sie eine 50-Milliliter-Spritze mit Sauerstoff aus einem Sauerstofftank mit einem Regler und einem Gasschlauch mit einer stumpfen 18-Gauge-Nadel. Injizieren Sie den Sauerstoff direkt in die Kammern, um sie zu etwa 500 mikromolarem Sauerstoff zu hyperoxygenisieren.
Führen Sie die Stopfen locker ein und warten Sie, bis der Sauerstoff etwa 480 Mikromolar erreicht. Schließen Sie die Kammer mit einer Drehbewegung langsam und lassen Sie die Atmung für etwa 15 bis 20 Minuten ausgleichen. Füllen Sie bei Bedarf die zentrale Kapillare des Stopfens mit MiR05.
Verwenden Sie spezielle Mikrospritzen, um Substrate, Entkoppler und Inhibitoren in vollständig geschlossene Kammern zu injizieren, um die Ereignisse für jede Kammer in Echtzeit zu benennen und mit einem Zeitstempel zu versehen. Wählen Sie F6, um die negativen Skalen für die Sauerstoffkonzentration und die Sauerstoffsteigung nach Bedarf anzupassen. Nach jeder Injektion waschen Sie die Spritze dreimal in Wasser für wasserlösliche Verbindungen und 70% Ethanol für ethanolgelöse Verbindungen.
Fügen Sie fünf Mikroliter 0,8-molares Malat hinzu und fahren Sie sofort mit der nächsten Injektion fort. Waschen Sie die Injektionsspritze dreimal in Wasser. Fügen Sie sofort fünf Mikroliter 1-molaren Pyruvat hinzu und warten Sie, bis sich die Atmung stabilisiert hat.
Nach dem Waschen der Spritze 10 Mikroliter 0,5-molares ADP hinzufügen und warten, bis sich die ADP-Reaktion stabilisiert hat. Waschen Sie die Spritze und fügen Sie fünf Mikroliter 2-molares Glutamat hinzu und warten Sie, bis sich die Atmung stabilisiert hat. Waschen Sie die Spritze, fügen Sie dann fünf Mikroliter 4-Millimolar Cytochrom-C hinzu und warten Sie, bis sich die Atmung stabilisiert hat.
Nach dem Waschen der Spritze 20 Mikroliter 1-Backensuccinat hinzufügen und warten, bis sich die Atmung stabilisiert hat. Titrieren Sie 0,5- bis 1-Mikroliter-Schritte von 1 Millimolar FCCP und warten Sie, bis sich die Atmung nach jeder Injektion stabilisiert hat. Fahren Sie fort, bis es keine zusätzliche Zunahme der Atmung gibt.
Waschen Sie die Injektionsspritze dreimal in 70% Ethanol. Fügen Sie zwei Mikroliter 150-mikromolaren Rotenon hinzu und warten Sie, bis sich die Atmung stabilisiert hat. Fügen Sie einen weiteren Mikroliter Rotenon hinzu, um sicherzustellen, dass es keine weitere Hemmung gibt.
Wenn die Atmung abnimmt, fahren Sie mit zusätzlichen Injektionen fort, bis die Atmung nicht abnimmt, und waschen Sie dann die Injektionsspritze dreimal in 70% Ethanol. Fügen Sie zwei Mikroliter 125-mikromolares Antimycin A hinzu und warten Sie, bis sich die Atmung stabilisiert hat. Fügen Sie einen weiteren Mikroliter Antimycin A hinzu, um sicherzustellen, dass es keine weitere Hemmung gibt.
Wenn die Atmung abnimmt, fahren Sie mit zusätzlichen Injektionen fort, bis die Atmung nicht abnimmt. Waschen Sie die Spritze dreimal mit 70% Ethanol. Überprüfen Sie die Sauerstoffkonzentration der Kammer.
Wenn die Konzentration unter 125-Mikromolar liegt, reoxygenieren Sie in die Raumluft oder leicht hyperoxygenat, um sicherzustellen, dass Sauerstoff den Atemfluss nicht einschränkt. Fügen Sie fünf Mikroliter 0,8-molares Ascorbat hinzu. Waschen Sie die Spritze dreimal in 70% Ethanol.
Fügen Sie sofort 10 Mikroliter 0,2-molare TMPD hinzu und warten Sie auf eine Zunahme der Atmung. Nach dem Waschen der Spritze mit Ethanol sofort 25 Mikroliter 4-molares Natriumazid hinzufügen, wenn der Atemfluss von Ascorbat TMPD plateaut. Beenden Sie die, indem Sie auf Datei, Speichern und trennen klicken.
Es wurde beobachtet, dass 40 Milligramm pro Milliliter Gewebehomogenat zu einem schnellen Sauerstoffmangel führten. Der Sauerstoffverbrauch verlangsamte sich mit 30 und 20 Milligramm pro Milliliter Gewebehomogenat erheblich, nahm aber in Abwesenheit von Substraten oder ADP in kurzer Zeit rapide ab. Die Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter gewebehomogenat führte zu einer optimalen Sauerstoffverbrauchsrate.
Ein SUIT-Protokoll wurde verwendet, um NADH- und Succinat-verknüpfte oxidative Phosphorylierung und Elektronentransfer sowie die Komplex-IV-Aktivität zu bewerten. Die Cytochrom-C-Freisetzung wurde in Gegenwart von Pyruvat und Malat oder Succinat und Rotenon beurteilt, die beide zeigten, dass das Homogenatpräparat die Mitochondrien nicht schädigte. Es wurde auch festgestellt, dass die NADH-gebundene oxidative Phosphorylierung bei EO771-Tumoren vernachlässigbar war.
Die Titration von FCCP zur Förderung des maximalen Elektronenflusses zeigte, dass bei EO771-Tumoren die Phosphorylierung und nicht die Oxidation auf die Atmung beschränkt war. Die homogenaten Atemprofile des Tumors ähnelten denen von nicht implantierten, digitoninpermeabilisierten EO771-Zellen, mit Ausnahme eines verminderten maximalen Elektronentransfers, der durch N- und S-chromosomale Substrate im Tumor unterstützt wurde. Die Respiratorische Kinetik von Succinat wurde durch schrittweise Titrationen von untersättigtem ADP weiter bewertet, bis die maximale Rate erreicht war.
Die halbmaximale Konzentration von ADP in Gegenwart von Succinat und Rotenon betrug 37,5 Mikromol, während die maximale Rate etwa 10,5 Picomol pro Sekunde pro Milligramm betrug. Instrumente, die in der Routineversorgung aufgestellt werden, sowie die Handhabung von Gewebe sind für den Erfolg dieser Experimente von entscheidender Bedeutung. Im Anschluss an diese Verfahren können je nach Fragestellung weitere masse- oder markerspezifische Ansätze zur Ratennormalisierung angewendet werden.
Gemeinsame Maßnahmen umfassen die Gesamtproteinquantifizierung und die enzymatische Aktivität der Citratsynthase, variieren jedoch je nach Modellsystem, statistischem Design und Forschungsfrage.
