Name: evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue
Uploaded: 2018-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue at JoVE.com

Diese Studie wird durch die Division der intramuralen Forschung von der National Institute of Nursing Research des NIH, Bethesda, Maryland vollständig unterstützt.

Die aktuelle Studie (NCT00852111) wurde durch die institutionelle Review Board (IRB) des National Institute of Health (NIH), Bethesda, Maryland genehmigt. Teilnehmer an dieser Studie eingeschrieben waren euthymischen Männer, die 18 Jahre oder älter, wer nicht-metastatischem Prostatakrebs mit oder ohne vorherige Prostatektomie diagnostiziert wurden und wurden geplant, um externen Strahl Strahlentherapie (EBRT) erhalten. Potentielle Teilnehmer ausgeschlossen waren, hätten sie eine fortschreitende Krankheit, die erhebliche Müdigkeit verursachen können psychiatrische Erkrankungen innerhalb der letzten fünf Jahre, hatte unkorrigierte Hypothyreose oder Anämie, oder hatte eine zweite Malignität. Personen, die Sedativa, Steroide oder nicht-steroidalen Entzündungshemmern verwendet wurden ebenfalls ausgeschlossen. Gesunden Blutproben wurden am NIH-Abteilung der Transfusionsmedizin von gesunden Spendern unter ein IRB genehmigten Protokoll (NCT00001846) erhalten. Alle Teilnehmer werden am Magnuson Clinical Research Center an der NIH rekrutiert. Unterschriebene schriftliche informierte Einwilligungen wurden vor der Teilnahme an der Studie erhalten.
1. mitochondriale Funktion Messung Vorbereitung (1. Tag des Experiments)
<ol><li>Sensorkassette-Hydrat (siehe Tabelle der Materialien; ungefähre Dauer: 5 min).<ol>
<li>Nehmen Sie Sensorkassette aus Verpackung. Fügen Sie 200 μL Kalibrator Lösung in jede Vertiefung der Dienstprogramm-Platte, dann füllen Sie jede Wassergraben mit 400 μl Kalibrator Lösung.</li>
		<li>Die Utility-Platte, die nun Kalibrator Lösung aufweist zurückzukehren Sie Sensorplatte. Hydrat die Patrone in einem Inkubator-CO2 37 ° C über Nacht. Hinweis: Sensorkassette muss für ein Minimum von 4 h und maximal 72 h hydratisiert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. klinische Probenvorbereitung (Tag 2 des Experiments)
<ol><li>Messen Sie mit dem 13-Element Bewertung der chronischen Krankheit Funktionstherapie - Müdigkeit (FACIT-F)2,23,24 bei Baseline (vor EBRT Einleitung), Mittelpunkt und Vollendung des EBRT und 1 Jahr Post-EBRT Müdigkeit.<ol>
<li>Verwenden Sie einen 0 - 4 Maßstab für jedes Element Reaktion, wobei 0 für "überhaupt nicht" und ein 4 weist darauf hin, dass der Beschwerdegegner bezieht sich auf die zugehörige Anweisung "sehr viel." Gesamtnoten sollte zwischen 16-53, mit niedrigeren Punktzahlen spiegelt hohe Müdigkeit Intensität liegen.</li>
		<li>Definieren Sie Müdigkeit als ein FACIT-F-Wert niedriger als 43, mit einem FACIT-F-Score von ≥43, fehlender oder nicht klinisch bedeutsamen Müdigkeit2angibt. Hinweis: Ein FACIT-F-Wert von 43 besten teilt Müdigkeit Resultate von Krebs-Patienten und die allgemeine Bevölkerung2.</li>
		<li>Umfassen die folgenden 13 Artikel in der FACIT-Müdigkeit-Skala: 1) ich fühle mich müde; (2) Ich fühle mich ganz schwach; (3) Ich fühle mich lustlos, ("ausgewaschen"); (4) Ich fühle mich müde; (5) Ich habe Probleme beim Starten Dinge, weil ich müde bin; (6) Ich habe Probleme, die Dinge zu beenden, weil ich müde bin; (7) Ich habe Energie; (8) Ich bin in der Lage, meine üblichen Tätigkeiten zu tun; (9) ich müssen tagsüber schlafen. (10) Ich bin zu müde, um zu essen; (11) Ich brauche Hilfe meine üblichen Aktivitäten; (12) Ich bin frustriert zu tun, was ich tun möchte, zu müde; und 13) ich habe meine sozialen Tätigkeit zu begrenzen, weil ich müde bin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBMC aus frisch gesammelten Blutproben zu isolieren (Dauer: 1 h).<ol>
<li>Sammeln Sie 8 mL Blut in eine mononukleären Zellen Vorbereitung Rohr (siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Blutproben sollten innerhalb von 2 h Kollektion verarbeitet werden. Die Qualität der PBMCs möglicherweise gefährdet, wenn Blutproben mehr als 2 h nach Musterkollektion verarbeitet werden.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 1.750 x g für 30 min bei Raumtemperatur (18-25 ° C). Übertragen Sie die trübe Schicht auf eine 15 mL konische Rohr. Fügen Sie bis zu 15 mL PBS und invertieren Sie 5 Mal zu.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 15 Minuten bei 4 ° C. Sorgfältig entfernen und entsorgen des Überstands ohne störende Pellet. Wieder aussetzen der Pellets durch Zugabe von bis zu 10 mL PBS, und 5 Mal zu invertieren.</li>
		<li>Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie Flüssigkeit überstand und auszusetzen Sie Zellen in 1 mL PBS wieder. Die PBMCs auf einem 1,5 mL Microfuge Rohr übertragen.</li>
		<li>Bei 610 X g für 10 Minuten zentrifugieren. Sorgfältig entfernen überstand und Aufschwemmen Pellet komplette RPMI-1640 (RPMI-1640 ergänzt mit 10 % FBS, 10 mM Penicillin/Streptomycin).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beschichten Zellplatten für nicht-anhaftende Zellen (Dauer: 30 min).<ol>
<li>Zell- und klebelösung vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien) durch eine Verdünnung der Stammlösung 0,1 M Natriumbicarbonat pH 8.0. Die Arbeitslösung sollte 3,5 µg/cm2 Fläche. Hinweis: Diese Lösung enthält Polyphenolen Proteine aus der marine Miesmuschel Mytilus Edulisgewonnen. Diese Proteine sind wichtige Komponenten des Klebers abgesondert von der Muschel, selbst auf Oberflächen zu verankern. Wir finden, dass Cell-Tak am besten mit PBMCs funktioniert.</li>
		<li>Jedes gut 100 μL der verdünnten Klebstoff-Lösung hinzu und mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie dreimal mit VE-Wasser und Luft trocknen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. die mitochondriale Funktion Messung
<ol><li>Vorbereitung der Assay-Medien (Dauer: 10 min). Hinweis: Assay Medien müssen am Tag des Experiments frisch zubereitet werden.<ol>
<li>Hinzufügen von L-Glutamin, Pyruvat und Glukose Base-Medien (die gleichen Bestandteile wie Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM), aber ohne Natrium Bikarbonat, Glukose, Glutamin oder Natrium Pyruvat) Assay Medien machen. Medien Aufwärmen auf 37 ° C, dann pH auf 7,4 einstellen. Hinweis: Konzentrationen von L-Glutamin, Pyruvat und Glukose sind in der Regel identisch mit Konzentrationen in normales Wachstumsmedien, aber anhand der Assay ist einstellbar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Der Mito Stresstest PBMCs vorbereiten (Dauer: 2 h).<ol>
<li>Platte genug PBMCs aus Schritt2 in jede Vertiefung, 80-90 % Konfluenz zu erreichen. Nach unserer Erfahrung hat 1,5 x 105 Zellen/Well die konstantesten Ergebnisse ergeben. Hinweis: Wells A und H sind Hintergrund Brunnen und sollte nur Assay Medien mit keine Zellen enthalten. In Brunnen B bis G empfehlen wir die Beschichtung mindestens 3-6 Brunnen pro Patientenprobe um Ausreißer Rechnung zu tragen.</li>
		<li>Spin-down Platten 200 X g für 2 min damit Zellen an der Unterseite der Brunnen zu halten. Waschen Sie die Zellen einmal mit Assay Medien. Dieser Schritt entfernt das Wachstumsmedium Serum und Natriumbicarbonat. Hinweis: Nach unserer Erfahrung die Waschschritt entfernt in der Regel 20-30 % der Zellen.</li>
		<li>Hinzufügen von 180 μL Assay Medien in jedem Brunnen, einschließlich Hintergrund Brunnen A und H. Inkubation in einem nicht-CO2 -37 ° C-Inkubator für 45-60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Läuft die Mito-Stress-Test<ol>
<li>Rekonstruieren Sie Drogen im Mito Stress Kit mit Assay Medien wie folgt:<ol>
<li>Oligomycin: Fügen Sie 252 μL Assay Medien in das Fläschchen, eine Stammlösung auf 50 μM zu generieren hinzu.</li>
			<li>FCCP: Fügen Sie 288 μL der Assay-Medien in das Fläschchen eine Stammlösung auf 50 μM zu erzeugen.</li>
			<li>Antimycin A / Rotenone: Fügen Sie 216 μL der Assay-Medien in die Flasche, eine Stammlösung auf 25 μM zu generieren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wirbel wieder ca. 1 Minute lang Drogen hergestellt. Verdünnen Sie in funktionierende Lösungen. Hinweis: Sollten Konzentrationen von der gebrauchslösungen titriert und vor dem Experiment je nach Zelltyp im Vorhinein festgelegt. Für PBMCs, finden wir, dass 1 μM Oligomycin, 1 μM FCCP und 0,5 μM Antimycin A / Rotenone arbeiten die besten.</li>
		<li>Pipette die Drogen in jedem Hafen in der sensorkassette nacheinander:<ol>
<li>Anschluss A: Pipette 20 μL von 10 μM Oligomycin für eine Endkonzentration in jede Vertiefung von 1 μM.</li>
			<li>Port B: Pipette 22 μL von 10 μM FCCP, für eine Endkonzentration in jede Vertiefung von 1 μM.</li>
			<li>Port C: Pipette 25 μL von 5 μM Antimycin A / Rotenon für eine Endkonzentration in jede Vertiefung von 0,5 μM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie "Mito-Stress-Test" auf einem extrazellulären Flux-Instrument. Folgen Sie Eingabeaufforderung, Instrument und legen Sie die Sensor-Patrone. Das Gerät wird automatisch Sensorkalibrierung durchführen. Setzen Sie die Zellplatte, nachdem Sensorkalibrierung und das Instrument den Rest des Tests zu beenden. Sauerstoff-Dynamik ist gemessen am 530 nm (Anregung) / 650nm (Emission), und Proton-Konzentration gemessen bei 470 nm (Anregung) / 530 nm (Emission).</li>
</ol>(4) Normalisierung der Funktion der Mitochondrien Daten
<ol><li>Bereiten Sie Cell Proliferation Assay-Lösung (Dauer: 5 min).<ol>
<li>11,7 mL PBS 48 μL Nukleinsäure-Fleck (500 X) und 240 μL Hintergrund Suppressor hinzufügen (2 X). Der Nukleinsäure-Fleck ist eine Zelle-permeationsfähigen DNA-Bindung-Farbstoff, und die Hintergrund-Suppressor ist eine Maskierung Farbstoff, der abgestorbenen Zellen oder Zellen mit kompromittierten Zellmembran Integrität von gebeizt wird blockiert. Die Kombination aus der DNA-Bindung-Farbstoff und die Hintergrund-Suppressor sorgt dafür, dass nur lebende Zellen gefärbt sind.</li>
		<li>Fügen Sie gleiches Volumen von 2 x Arbeitslösung (180 μL hinzu) nach der Mito-Stress-Test abgeschlossen wurde direkt in das Medium in jede Vertiefung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen in Anwesenheit von Zelle Verbreitung Assay Lösung in einem Inkubator 37 ° C für 45-60 min. Quantify die Anzahl von lebenden Zellen (fluoreszierend) auf eine Platte Leser bei 508 nm (Anregung) / 527 nm (Emission) und OCR-Daten zu normalisieren (Dauer: 10 min) . Hinweis: Zusätzlich zu der Nummer lebenden Zellen, Benutzer können auch ihre Daten mit der Gesamtzahl der Zellen, Höhe der Nukleinsäure, proteinkonzentrationen usw.zu normalisieren.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Berger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-Related+Fatigue,+Version+2.2015.">Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).</li><li>Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+phenotyping+approaches+lead+to+dissimilar+biologic+profiles+in+men+with+chronic+fatigue+following+radiation+therapy.">Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).</li><li>Feng, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Predictors+of+Fatigue+in+Men+With+Non-Metastatic+Prostate+Cancer+Receiving+External+Beam+Radiation+Therapy.">Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).</li><li>Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploratory+Investigation+of+Early+Biomarkers+for+Chronic+Fatigue+in+Prostate+Cancer+Patients+Following+Radiation+Therapy.">Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy.</a> Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).</li><li>Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+fatigue+syndrome+and+mitochondrial+dysfunction.">Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2 (1), 1-16 (2009).</li><li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mito-Morphosis:+Mitochondrial+Fusion,+Fission,+and+Cristae+Remodeling+as+Key+Mediators+of+Cellular+Function.">Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function.</a> Annual Review of Physiology. 78 (1), 505-531 (2016).</li><li>Vecchiet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+characterization+of+somatic+parietal+tissues+in+humans+with+chronic+fatigue+syndrome.">Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome.</a> Neuroscience Letters. 208 (2), 117-120 (1996).</li><li>Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+in+pH+handling+by+peripheral+muscle+and+potential+regulation+by+the+autonomic+nervous+system+in+chronic+fatigue+syndrome.">Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome.</a> Journal of Internal Medicine. 267 (4), 394-401 (2010).</li><li>Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TRAIL+in+fatigue+induced+by+repeated+stress+from+radiotherapy.">The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy.</a> Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).</li><li>Karamercan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+peripheral+blood+mononuclear+cells+be+used+as+a+proxy+for+mitochondrial+dysfunction+in+vital+organs+during+hemorrhagic+shock+and+resuscitation.">Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation.</a> Shock. 40 (6), (2013).</li><li>Ijsselmuiden, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+white+blood+cells+and+platelets+amplify+oxidative+stress+in+heart+failure.">Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure.</a> Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).</li><li>Kong, C. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+mitochondrial+alterations+after+cardiac+surgery+involving+cardiopulmonary+bypass:+Clinical+correlations.">Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations.</a> Shock. 21 (4), 315-319 (2004).</li><li>Straub, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+and+immune+system+prompt+energy+shortage+in+chronic+inflammation+and+ageing.">The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).</li><li>Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetics+of+immune+cells+to+assess+rheumatic+disease+activity+and+efficacy+of+glucocorticoid+treatment.">Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).</li><li>Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+mitochondrial+and+glycolytic+metabolism+in+human+platelets+and+leukocytes:+Implications+for+their+use+as+bioenergetic+biomarkers.">A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers.</a> Redox Biology. 2, 206-210 (2014).</li><li>Garrabou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+Sepsis+on+Mitochondria.">The Effects of Sepsis on Mitochondria.</a> The Journal of Infectious Diseases. 205 (3), 392-400 (2012).</li><li>Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+inflammation+and+tissue+injury.">Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (7), 1126-1167 (2014).</li><li>Adrie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+and+Apoptosis+Peripheral+Blood+Monocytes+in+Severe+Human+Sepsis.">Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (3), 389-395 (2001).</li><li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes.">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).</li><li>Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+characterization+of+polarized+M1+and+M2+bone+marrow-derived+macrophages+using+real-time+extracellular+flux+analysis.">Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).</li><li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements.">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).</li><li>Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+fatigue+and+other+anemia-related+symptoms+with+the+Functional+Assessment+of+Cancer+Therapy+(FACT)+measurement+system.">Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).</li><li>Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+important+differences+were+estimated+for+six+Patient-Reported+Outcomes+Measurement+Information+System-Cancer+scales+in+advanced-stage+cancer+patients.">Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients.</a> Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).</li><li>Kang, J. -. G., Wang, P. -. y., Hwang, P. M., Galluzzi, L., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 542, 209-221 (2014).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).</li><li>Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+determination+of+cell+number+using+the+CyQUANT&#174;+cell+proliferation+assay.">Sensitive determination of cell number using the CyQUANT&#174; cell proliferation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).</li><li>Hartman, M. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relation+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+vascular+function+in+type+2+diabetes+mellitus.">Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus.</a> Vascular Medicine. 19 (1), 67-74 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Fatigue bei Krebspatienten ist ein lähmenden Zustand, ist nicht klar definiert oder1gekennzeichnet. Diagnose von Müdigkeit setzt ganz auf subjektive Berichterstattung und gibt es keine aktuellen diagnostischen Standard oder Behandlung für diese Bedingung, vor allem auf einen Mangel an Verständnis in Pathobiologie2. Beeinträchtigung der Funktion der Mitochondrien ist die vorgeschlagenen Mechanismen, Müdigkeit bei Krebspatienten einer der am meisten therapeutisch Aktion...

Müdigkeit ist eine weit verbreitet und bedrückende Bedingung, die eine negative Auswirkung auf die Lebensqualität von Krebs Patienten1hat. Zu diesem Zeitpunkt Krebs Müdigkeit bleibt schlecht definiert und verlässt sich nur auf subjektive Berichterstattung durch die Patienten2. Daher ist dringend notwendig, eine leicht anpassbar diagnostische Labortest zur Charakterisierung von Müdigkeit in der klinischen Einstellung3,4Objektiv zu identifizieren.
Mehrere zugrunde liegende Mechanismen, einschließlich der Dysfunktion der Mitochondrien, sind vorgeschlagen worden, um Müdigkeit5verursachen. Mitochondrien sind die Kraftpaket Organellen, Bereitstellung von 95 % der zellulären Energiebedarf über Oxidative Phosphorylierung und spielen eine wichtige Rolle im Kalzium-Signalisierung, Apoptose, immun-Signalisierung und Regulierung von anderen intrazellulären Signal Veranstaltungen6 . Dementsprechend können zu Müdigkeit beeinträchtigt mitochondriale Bioenergetik und Mängel in der Energieerzeugung beitragen. Diese Hypothese zu unterstützen, haben frühere Studien Mutationen in der mitochondrialen DNA bei Patienten mit chronischen Ermüdung-Syndrom7beobachtet. Während es unklar bleibt, ob der pathophysiologische Ursprung der Müdigkeit liegt innerhalb des zentralen Nervensystems oder der peripheren Geweben, z. B. Skelettmuskulatur8,9, gibt es derzeit keine direkte Methode zum einschätzen mitochondriale Dysfunktion im Zusammenhang mit Müdigkeit in live, atmenden Zellen.
Mit peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) Funktion der Mitochondrien zu studieren, bietet mehrere Vorteile. Erstens PBMCs sind leicht zugänglich in der klinischen Einstellung mit standard Aderlass und können schnell mit grundlegende Labortechniken isoliert werden. Blutentnahme ist weniger invasiv als andere Gewebe wie ein Muskelbiopsie zu sammeln. So können Blutproben vom selben Patienten wiederholt im Laufe der Zeit gesammelt werden die longitudinalen Beurteilung der behandlungseffekte erleichtert. Interessanterweise schien mitochondriale Funktion in PBMCs mit Niere mitochondriale Status in einem Tiermodell10gut korreliert werden. Darüber hinaus wurden Immunzelle Mitochondrien als Proxy für systemische Veränderungen unter verschiedenen Krankheiten Bedingungen11,12verwendet. Mitochondrien in zirkulierenden Immunzellen sind besonders empfindlich auf Veränderungen der Immunfunktionen und immun Signalmoleküle wie Zytokine13,14,15. Zum Beispiel wurde beobachtet, dass PBMCs von Patienten mit akuten entzündlichen Rheumaerkrankungen hohe Ausgangswert Sauerstoff Verbrauch14aufweisen. Im Gegensatz dazu reduzierte Sauerstoffverbrauch in PBMCs von Patienten mit systemischen entzündlichen Erkrankungen einschließlich Sepsis16isoliert. Unter entzündlichen Erkrankungen können freie Radikale produziert von dysfunktionalen Mitochondrien erhöhten oxidativen Stress und längerer Entzündung17fördern. Die zentrale Rolle der Mitochondrien in der Energieerzeugung als auch oxidativen Stress schlägt den potenziellen Nutzen der mitochondrialen Funktion als Proxy für das Studium Müdigkeit bei Krebs Patienten 13.
Frühere Studien, die Funktion der Mitochondrien verwendet, biochemischen Techniken, mögliche Messung Mitochondrien-Membran oder Isolierung von bestimmten Zell-Populationen, die möglicherweise nicht bereitwillig anpassungsfähig in der klinischen Einstellung5, 14,18. In den letzten Jahren die Entwicklung von extrazellulären Flussmittel Assays hat konnten Forscher leicht und genau untersuchen Änderungen in Sauerstoff-Verbrauch (OCR) in Reaktion auf automatisierte Injektionen von Atmungs-Hemmer19,20 , 21 , 22. jedoch die meisten dieser Studien eignen sich für bestimmte Zelltypen und das große Hochdurchsatz-Format möglicherweise nicht anwendbar in einem klinischen Umfeld. In diesem Manuskript beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Prüfung der Funktion der Mitochondrien für die klinische Anwendung.

<table><tbody><tr><td>CPT Mononuclear Cells Preparation Tube&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>For isolating PBMCs following phlebotomy</td></tr><tr><td>RPMI-1640&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-040</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>For making growth media for PBMCs</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface</td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant Solution</td><td>Agilent</td><td>103059-000</td><td>For hydrating cartridges</td></tr><tr><td>XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges)</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td>Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges</td></tr><tr><td>XF base media</td><td>Agilent</td><td>103335-100</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>45% cell culture D-(+)-Glucose solution</td><td>Corning</td><td>25-037-CI</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>25-000-CI</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>L-glutamine solution</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td>For making XF assay media</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Mito Stress Test Kit</td><td>Agilent</td><td>103010-100</td><td>Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone</td></tr><tr><td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay</td><td>ThermoFisher</td><td>C35011</td><td>For quantification of live cells and data normalization</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Analyzer</td><td>Agilent</td><td>S7802AEA</td><td>For measuring mitochondrial function in live cells</td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate)</td><td>BioTek</td><td>BTCYT5PV</td><td>For quantification of live cells and data normalization</td></tr></tbody></table>

evaluating the role of mitochondrial function in cancer-related fatigue

Müdigkeit ist eine gemeinsame und schwächenden Erkrankung, die meisten Krebspatienten betroffen. Bisher testen Müdigkeit bleibt schlecht gekennzeichnet mit keine Diagnose Objektiv messen die Schwere dieser Erkrankung. Hier beschreiben wir eine optimierte Methode zur Beurteilung der Funktion der Mitochondrien der PBMCs von ermüdeten Krebspatienten gesammelt. Mit einem kompakten extrazelluläre Flux System und sequentielle Einspritzung der Atemwege Inhibitoren, untersuchten wir PBMC mitochondriale funktionellen Status durch Messung des basalen mitochondriale Atmung, Atemwege Kapazitätsreserven und Energie Phänotyp, der beschreibt die bevorzugte Energiepfad, auf stress zu reagieren. Frische PBMCs sind leicht zugänglich in der klinischen Einstellung mit standard Aderlass. Der gesamte Test beschrieben in diesem Protokoll kann in weniger als 4 Stunden ohne die Einbeziehung der komplexen biochemischen Techniken erfolgen. Darüber hinaus beschreiben wir eine Normalisierung Methode, die für den Erhalt reproduzierbare Daten notwendig ist. Vorgestellten einfachen Verfahren und Normalisierung Methoden ermöglichen wiederholte Probenentnahme aus dem gleichen Patienten und Generierung von reproduzierbaren Daten, die zwischen den Zeitpunkten auszuwertende potenzielle behandlungseffekte verglichen werden können.

Die Mito-Stress-Test beruht auf Messung der Sauerstoff-Verbrauch (OCR) nach sequentielle Einspritzung von verschiedenen Atemwege Inhibitoren ein vollständiges mitochondriale Profil zuordnen. OCR-Messungen nach jeder Injektion von Drogen verwendet werden kann, um die folgenden Parameter zu berechnen im Zusammenhang mit mitochondrialen Gesundheit: Basale OCR bemisst sich zunächst vor jeder Injektion von Drogen Sauerstoffverbrauch musste erfüllen ruht auf ATP-Bedarf einzu...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue at JoVE.com

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Unser Ziel war es, eine praktische Protokoll zur Bewertung der mitochondrialen Dysfunktion mit Müdigkeit bei Krebspatienten zu entwickeln. Dieses innovative Protokoll ist für die klinische Anwendung mit nur standard Aderlass und grundlegende Laborverfahren optimiert.

Bewertung der Rolle der mitochondrialen Funktion in krebsbedingte Fatigue

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

evaluating-role-mitochondrial-function-cancer-related

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Cancer Research

9.1K Aufrufe.  National Institutes of Health. Unser Ziel war es, eine praktische Protokoll zur Bewertung der mitochondrialen Dysfunktion mit Müdigkeit bei Krebspatienten zu entwickeln. Dieses innovative Protokoll ist für die klinische Anwendung mit nur standard Aderlass und grundlegende Laborverfahren optimiert.

Serie: Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic pathways is tested in many types of tumors. Thus, characterization of cancer cell metabolic setup is inevitable in order to target the correct pathway to improve the overall outcome of patients. Unfortunately, in a majority of cancers, the malignant cells are quite difficult to obtain in higher numbers and the tissue biopsy is required. Leukemia is an exception, where a sufficient number of leukemic cells can be isolated from the bone marrow. Here, we provide a detailed protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and subsequent analysis of their metabolic state using extracellular flux analyzer. Leukemic cells are isolated by the density gradient, which does not affect their viability. The next cultivation step helps them to regenerate, thus the metabolic state measured is the state of cells in optimal conditions. This protocol allows achieving consistent, well-standardized results, which could be used for the personalized therapy.

Here we present a protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and analysis of their metabolic state. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells could help to better characterize the demand of primary cells and could lead up to more personalized medicine.

Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Forschung

Krebsforschung

The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of current interventions to adequately treat fatigue in all patients leaves a need for new treatment options. Despite the therapeutic need and importance of preclinical research in helping identify promising novel treatments, few preclinical assays of fatigue are available. Moreover, the most common preclinical assay used to assess fatigue-like behavior, voluntary wheel running, is not suitable for use with some strains of mice, may not be sensitive to drugs that reduce fatigue, and has relatively low throughput. The current protocol describes a novel, non-voluntary preclinical assay of fatigue-like behavior, the treadmill fatigue test, and provides evidence of its efficacy in detecting fatigue-like behavior in mice treated with a chemotherapy drug known to cause fatigue in humans and fatigue-like behavior in animals. This assay may be a beneficial alternative to wheel running, as fatigue-like behavior and potential interventions can be assessed in a greater number of mice over a shorter time frame, thus permitting faster discovery of new therapeutic options.

Fatigue is a common, undertreated and frequently poorly-understood symptom in many diseases and disorders. New preclinical assays of fatigue may help to improve current understanding and future treatment of fatigue. To that end, the current protocol provides a novel means of measuring fatigue-like behavior in the mouse.

Die Tretmühle Ermüdungstest: Eine einfache, Hochdurchsatz-Assay von Fatigue-ähnliches Verhalten für die Maus

Fatigue is a prominent symptom in many diseases and disorders and reduces quality of life for many people. The lack of clear pathogenesis and failure of ...

Verhalten

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule synthesis. Genetic and functional adaptations of mitochondria to the tumor environment drive proliferative and metastatic potential. The advent of DNA and RNA sequencing removed critical barriers to the evaluation of genetic mediators of tumorigenesis. However, to date, methodological approaches to evaluate tumor mitochondrial function remain elusive and require technical proficiency limiting the feasibility, ultimately diminishing diagnostic and prognostic value in both experimental and clinical settings. Here, we&#160;outline a simple and rapid method to quantify rates of oxidative phosphorylation (OXPHOS) and electron transfer (ET) capacity in freshly excised solid tumor homogenates using high-resolution respirometry. The protocol can be reproducibly applied across species and tumor types as well as adapted to evaluate a diversity of mitochondrial ET pathways. Using this protocol, we demonstrate that mice bearing a luminal B mammary cancer exhibit defective nicotinamide adenine dinucleotide-linked respiration and reliance on succinate to generate adenosine triphosphate via OXPHOS.

We developed a practical protocol and analytical approach to evaluate mitochondrial oxidative phosphorylation and electron transfer capacity in fresh tumor homogenates. This protocol can be easily adapted to survey various mitochondrial functions that contribute to cancer initiation, progression, and treatment response.

Analytische Bestimmung der mitochondrialen Funktion von exzidierten soliden Tumorhomogenaten

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

Transmitochondriale Cybrid-Erzeugung aus suspensionszüchtenden Krebszellen

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more efforts are still needed to fully understand the link involving alterations in mitochondria and tumorigenesis, as well as to identify tumor-associated mitochondrial phenotypes. For instance, to evaluate the contribution of mitochondria in tumorigenesis and metastasis processes, it is essential to understand the influence of mitochondria from tumor cells in different nuclear environments. For this purpose, one possible approach consists of transferring mitochondria into a different nuclear background to obtain the so-called cybrid cells. In the traditional cybridization techniques, a cell line lacking mtDNA (&#961;0, nuclear donor cell) is repopulated with mitochondria derived from either enucleated cells or platelets. However, the enucleation process requires good cell adhesion to the culture plate, a feature that is partially or completely lost in many cases in invasive cells. In addition, another difficulty found in the traditional methods is achieving complete removal of the endogenous mtDNA from the mitochondrial-recipient cell line to obtain pure nuclear and mitochondrial DNA backgrounds, avoiding the presence of two different mtDNA species in the generated cybrid. In this work, we present a mitochondrial exchange protocol applied to suspension-growing cancer cells based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria. This methodology allows us to overcome the limitations of the traditional approaches, and thus can be used as a tool to expand the comprehension of the mitochondrial role in cancer progression and metastasis.

Autor im Rampenlicht: Transmitochondriale Cybridengenerierung unter Verwendung von Krebszelllinien  

This protocol describes a technique for cybrid generation from suspension-growing cancer cells as a tool to study the role of mitochondria in the tumorigenic process.

Transmitochondriale Cybrid-Generierung mit Hilfe von Krebszelllinien

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Assessing Mitochondrial Function in Sciatic Nerve by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple causes, including autoimmune diseases, diabetes, infections, inherited disorders, and tumors. Assessing mitochondrial function in mouse peripheral nerves can be challenging due to the small sample size, a limited number of mitochondria present in the tissue, and the presence of a myelin sheath. The technique described in this work minimizes these challenges by using a unique permeabilization protocol adapted from one used for muscle fibers, to assess sciatic nerve mitochondrial function instead of isolating the mitochondria from the tissue. By measuring fluorimetric reactive species production with Amplex Red/Peroxidase and comparing different mitochondrial substrates and inhibitors in saponin-permeabilized nerves, it was possible to detect mitochondrial respiratory states, reactive oxygen species (ROS), and the activity of mitochondrial complexes simultaneously. Therefore, the method presented here offers advantages compared to the assessment of mitochondrial function by other techniques.

High-resolution respirometry coupled to fluorescence sensors determines mitochondrial oxygen consumption and reactive oxygen species (ROS) generation. The present protocol describes a technique to assess mitochondrial respiratory rates and ROS production in the permeabilized sciatic nerve.

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Mitochondrial dysfunction in peripheral nerves accompanies several diseases associated with peripheral neuropathy, which can be triggered by multiple ...

Biochemie

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Phosphor-31 Magnet-Resonanz-Spektroskopie: Ein Werkzeug zur Messung<em&gt; In Vivo</em&gt; Mitochondrial Oxidative Phosphorylierung Kapazität im menschlichen Skelettmuskel

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Medizin

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and oxidative burst, and create neutrophil extracellular traps (NETs) for microbial clearance. New insights into the metabolic activities of neutrophils challenge the early concept that they primarily rely on glycolysis. Precise measurement of metabolic activities can unfold different metabolic requirements of neutrophils, including the tricarboxylic acid (TCA) cycle (also known as the Krebs cycle), oxidative phosphorylation (OXPHOS), pentose phosphate pathway (PPP), and fatty acid oxidation (FAO) under physiological conditions and in disease states. This paper describes a step-by-step protocol and prerequirements to measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration on mouse bone marrow-derived neutrophils, human blood-derived neutrophils, and the neutrophil-like HL60 cell line, using metabolic flux analysis on a metabolic extracellular flux analyzer. This method can be used for quantifying the mitochondrial functions of neutrophils under normal and disease conditions.

We describe stepwise protocols measuring the mitochondrial respiration of mouse and human neutrophils and HL60 cells using the metabolic extracellular flux analyzer.

Echtzeitmessung des mitochondrialen bioenergetischen Profils von Neutrophilen

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Immunologie und Infektion

Use of Minimally Invasive Methods to Assess Fuel Utilization and Circadian Rhythms in Older Adults

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic disease. Although the etiology of age-related physical disability is complex and multifactorial, the decline in mitochondrial function appears to coincide with the progression of functional decline in many older adults. The reason why there is a decrease in mitochondrial function with aging remains elusive, but emerging science indicates that both fuel metabolism and circadian rhythms can influence mitochondrial function.
Recent studies have established that circadian rhythms become disturbed with aging, and that disrupted circadian rhythms have pathological consequences that impact mitochondrial function and overlap with many age-associated chronic diseases. Current quantitative methods for direct assessment of mitochondrial function are invasive and typically require a muscle biopsy, which can pose difficulties with participant recruitment and study adherence, given the perceived levels of potential pain and risk. Thus, an innovative and relatively noninvasive protocol to assess changes in mitochondrial function at the cellular level and circadian patterns in older adults was adapted. Specifically, a real-time metabolic flux analyzer is used to assess the mitochondrial bioenergetic function of white blood cells under differential substrate availability.
The expression of circadian clock genes in white blood cells to cross-correlate with the mitochondrial bioenergetics and circadian rhythm outcomes are also analyzed. It is believed that these innovative methodological approaches will aid future clinical trials by providing minimally invasive methods for studying mitochondrial substrate preference and circadian rhythms in older adults.

<meta charset="utf8"></head><body>Einsatz minimal-invasiver Methoden zur Beurteilung des Kraftstoffverbrauchs und des zirkadianen Rhythmus bei älteren Erwachsenen

A novel and minimally invasive protocol is presented to evaluate the synergistic impact of fuel utilization and circadian rhythms on aging individuals, utilizing peripheral blood mononuclear cells.

Einsatz minimal-invasiver Methoden zur Beurteilung des Kraftstoffverbrauchs und des zirkadianen Rhythmus bei älteren Erwachsenen

Aging is associated with multiple physiological changes that contribute synergistically and independently to physical disability and the risk of chronic ...

Bewertung der Rolle der mitochondrialen Funktion in krebsbedingte Fatigue

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Bewertung des metabolischen Profils der primäre Leukämie-Zellen

Die Tretmühle Ermüdungstest: Eine einfache, Hochdurchsatz-Assay von Fatigue-ähnliches Verhalten für die Maus

Analytische Bestimmung der mitochondrialen Funktion von exzidierten soliden Tumorhomogenaten

Transmitochondriale Cybrid-Generierung mit Hilfe von Krebszelllinien

Transmitochondriale Cybrid-Generierung mit Hilfe von Krebszelllinien

Transmitochondriale Cybrid-Generierung mit Hilfe von Krebszelllinien

Beurteilung der mitochondrialen Funktion im Ischiasnerv durch hochauflösende Respirometrie

Phosphor-31 Magnet-Resonanz-Spektroskopie: Ein Werkzeug zur Messung

Echtzeitmessung des mitochondrialen bioenergetischen Profils von Neutrophilen

Einsatz minimal-invasiver Methoden zur Beurteilung des Kraftstoffverbrauchs und des zirkadianen Rhythmus bei älteren Erwachsenen