Bis heute sind die zerebralen Organoide, die von pluripotenten Stammzellen unterschieden werden, ein vitro 3D-Modell, das dem nativen menschlichen Hirngewebe am nächsten kommt. Darüber hinaus eignen sich zerebrale Organoide gleichermaßen für die Modellierung verschiedener Pathologien des zentralen Nervensystems, die Untersuchung pharmakologisch wirksamer Substanzen und auch für den Einsatz in der regenerativen Medizin. Mittlerweile befindet sich diese Technologie noch im Anfangsstadium der Entwicklung.
Das Protokoll kann in zwei Gruppen unterteilt werden, abhängig von der Methode der Gewinnung von Aggregaten und der weiteren Kultivierung mit Differenzierung. Die erste umfasst Protokolle und Differenzierungsschemata, die sich in der Kultivierungszeit unterscheiden, und Differenzierungsinduktoren mit anschließender Reifung des Organoids im Shaker in speziellen Geräten mit geringer Haftung wie Marktröhren oder Platten. Eine weitere Gruppe umfasst die Verwendung eines speziellen Bioreaktors.
Die Analyse verschiedener Protokolle hat gezeigt, dass Organoide unter Bedingungen mit zirkulierendem Nährmedium kultiviert werden sollten. Das Fehlen einfacher und kostengünstiger Systeme zur Gewinnung von Organoiden mit einer Standardgröße und -morphologie erfordert jedoch die Entwicklung solcher Vorrichtungen zur Skalierung des Prozesses. In dieser Arbeit beschreiben wir unsere Methode zur Gewinnung und Prüfung einfacher und kostengünstiger Mini-Bioreaktoren, die es ermöglichen, große Mengen hochwertiger Organoide zu erhalten.
Schneiden Sie die sterilen 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen in die Ringe, 7 oder 8 Millimeter hoch. Autoklavieren Sie die Ringe. Brechen Sie niedrige Aggregationen auf behandelten oder mikrobiologischen Petrischalen in Krümel auf.
Lösen Sie etwa 1 Gramm Kunststoffkrümel über Nacht in 10 Milliliter Chloroform auf, um einen flüssigen Kunststoff herzustellen. Machen Sie einen Kunststoffknopf in der Mitte einer sterilen, ultra-niedrigen Haftung 6 Zentimeter Petrischale. Es gibt zwei gleichermaßen geeignete Wege.
Die erste, legen Sie den Autoklaven in einen Kunststoffring auf eine Mitte und tragen Sie halbe Milliliter flüssigen Kunststoffs auf die Innenseite des Rings auf. Die zweite, ohne Plastikringe, lässt halbe Milliliter flüssigen Kunststoffs auf die Mitte der Petrischale fallen. Lassen Sie das Geschirr für 2 oder 3 Stunden in einer Laminar-Flow-Haube bis zur vollständigen Trockenheit offen.
Kultivieren Sie induzierte pluripotente Stammzellen im Medium für pluripotente Stammzellen, bis zu 75 oder 90% Konfluenz in den 35 Millimeter Petrischalen, vorbeschichtet mit einer Matrix, die in kaltem Dulbecco Modified Eagle Medium und Fisher-12 Medium gelöst ist. Bereiten Sie Medium A plus Serumersatz vor. Kultivieren Sie induzierte pluripotente Stammzellen für 1 Tag im Medium mit Serumersatz.
Wechseln Sie das Medium für pluripotente Stammzellen am Tag Null der Differenzierung in ein Serumersatzmedium. Bereiten Sie Medium A vor.Ändern Sie das Medium am Tag 2 der Differenzierung in Medium A. Kultivieren Sie Zellen in Medium A für 2 Wochen, erfrischendes Medium in Petrischalen alle 2 Tage.
Beginnen Sie am Tag 14 mit der Bildung von Sphäroiden unter Verwendung einer speziellen 24-Well-Kulturplatte, die in jedem Bohrloch etwa 1.200 Mikrobohrungen enthält. Bereiten Sie eine 24-Well-Kulturplatte mit Mikrotiterlöchern vor. Zu jeder Vertiefung 1 Milliliter Medium A geben, kurz bei 1,300g für 5 Minuten in einem schaukelbaren Eimerrotor mit Plattenhalter zentrifugieren.
Kontrollieren Sie unter dem Mikroskop, dass es keine Blasen in Mikrotrossen gibt. Bereiten Sie das Medium B vor.Entfernen Sie das Medium aus der Petrischale. Für die Zellablösung behandeln Sie die Zellen mit 1,5 Milliliter EDTA-Lösung, die auf PBS hergestellt wird.
Kontrollieren Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop. Ernten Sie die Zelle in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie 5 Milliliter gemischtes Dulbecco- und Fisher-Medium in das Röhrchen in Richtung der Zellen hinzu.
Zentrifugiere bei 200g für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 2 Millilitern Medium B.Übertragen Sie die Zellsuspension mit 1 Milliarde Zellen in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Mikrobohrungen. Zellen mehrmals vorsichtig nach oben und unten pipettieren und 100 g für 1 Minute kurz zentrifugieren, um die Zelle in Mikrotiterlöchern einzufangen.
Kontrollieren Sie unter dem Mikroskop, dass die Zellen gleichmäßig in Mikrotrinnen verteilt sind. Inkubieren Sie die Platte über Nacht für die Zellaggregation in Sphäroide. Überprüfen Sie am nächsten Morgen, Tag 15, unter den Mikroskopen die Qualität der Sphäroide, die transparent und glatt sind, wenn sie gesund sind.
Sammeln Sie die Sphäroide vorsichtig aus jeder Vertiefung in einem 15-Milliliter-Rohr, lassen Sie die Sphäroide 2 und 3 Minuten lang durch schwerkraft ausfallen und entfernen Sie dann den Überstand. Zu den Sphäroide werden 2 Milliliter der Matrix, aufgetaut und ex tempore auf Eis, gegeben. Durch Pipettieren vorsichtig mischen und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren.
Um den Überschuss der Matrix zu waschen, fügen Sie dem Röhrchen 8 Milliliter Medium B.Pipette vorsichtig hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen dann für 1 Minute bei 100 g. Entfernen Sie den Überstand. In das Röhrchen 20 Milliliter Medium B geben, vorsichtig pipettieren und dann die Sphäroidesuspension zwischen Mini-Bioreaktoren aufteilen.
Dann legen Sie die Mini-Bioreaktoren in eine 15 Zentimeter große Petrischale, die die Verdunstung von Wasser und Verunreinigungen verhindert. Legen Sie die Petrischale mit Mini-Bioreaktoren auf einen Orbitalschüttler. Kultivieren Sie die Organoide mit einer Rotationsrate von 70, 75 U / min.
Bereiten Sie am Tag 16 medium C vor.Transfer Organoid in 50 Milliliter Röhrchen. Lassen Sie sie für 5 Minuten auf den Boden fallen. Aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie 5 Milliliter des Mediums C hinzu.Verbinden Sie die Organoide in den Mini-Bioreaktoren.
Kultivieren Sie Sphäroide in Medium C für 2 Wochen und erfrischen Sie das Medium alle 2 Tage. Wählen Sie während dieser 2 Wochen etwa 100 Sphäroide pro Mini-Bioreaktor für die folgende Kultivierung aus. Bereiten Sie am Tag 30 das Medium D vor.Wechseln Sie das Kultivierungsmedium in das Medium D, das ein Reifemedium ist.
Kultivierungsmedium alle 2 oder 3 Tage für 3 Wochen auffrischen. Verwenden Sie dann das medium D gelöst in F und GDNF. Nach 1 Monat aufeinanderfolgender Kultivierung in Medium A und B werden Organoide erhalten, die in Größe und Morphologie standardisiert sind.
Wenn es wächst, müssen sie das Medium häufiger wechseln, bis zu 4 Mal pro Woche erhöht sich auch. Nach 2 Monaten Kultivierung erreichen sie einen Durchmesser von 4 und 5 Millimetern. Und nach einem weiteren Monat 5 und 6 Millimeter und das Wachstum hört auf.
Die Abbildung zeigt das Aussehen von Organoidenzym, klare Abschnitte, die mit Hämatoxylin und Eosin gemalt sind. Die immunhistochemische Analyse für 1 Monat zeigt das Vorhandensein von SOX2-positiven Clustern von Vorläuferzellen, einschließlich des zentralen Teils. In der Peripherie der Organoide, Gliafibrillär saures Protein, Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 und Thiazin Hydrolase positiv.
Zellen sind konzentriert, was der reifen Form von Neuronen entspricht. In einigen Fällen bilden sich im zentralen Teil Cluster von Weißen auf nekrotischem Bereich. Dies zeigt die Einschränkung dieses Protokolls für die Gewinnung größerer Organoide an.
Höchstwahrscheinlich ist der begrenzende Faktor des Wachstums die Diffusionsrate von Nährstoffen und Sauerstoff. Die verschiedenen Medien und Zelltypen von Sphäroide und das Testen unseres Systems auf einige Arten von Organoiden. Viel Gehirn und Netzhaut, kombinierte Organoide aus Leberkarzinomzellen und mesenchymalen Stammzellen, kombinierte Organoide aus Kapitalexplosions-mesenchymalen Stammrufen und die hämatopoetische Stammzellen Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen und Darmorganoiden.
War es variabel in der anfänglichen Zusammensetzung der Zellen? Differenzierungsfaktoren, Kultur und Medium, extrazelluläre Matrix und möglicherweise auch die Zusammensetzung des Gasgemisches, die Geschwindigkeit der Plattformrotation und andere Parameter. Es wird möglich sein, Organoide mit der gleichen Form, Größe oder dem gleichen Morphologiemodell in verschiedenen Organen und Geweben zu erhalten.
Die Verwendung von Mini-Bioreaktoren, die in dieser Arbeit vorgeschlagen wurden.
