Wir stellen ein Protokoll zur Erzeugung eines menschlichen Gehirnorganoids vor, das residente Mikroglia und Neuronen enthält, indem induzierte pluripotente Stammzellen aus hämatopoetischen progenen Zellen in den Induktions- und Entwicklungsprozess von neuronalen Organoiden integriert werden. Diese Methode bietet ein Modell, um die Wechselwirkungen zwischen Mikroglia und Neuronen während der Entwicklung des menschlichen Gehirns zu untersuchen. 3D-Hirn-Organoide sind Mini-Gehirne, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen oder iPSCs erzeugt werden.
Als Alternative zu Tieren und Menschen wurden sie häufig zur Nachahmung des menschlichen Gehirns in der Erforschung der Gehirnentwicklung und neurologischen Störungen eingesetzt. Sie sind großartige Werkzeuge, um die Forschung im Bereich der menschlichen Gesundheit voranzutreiben. Herkömmliche Protokolle für 3D-Organoide des menschlichen Gehirns erzeugen selten Mikroglia, die residenten Immunzellen des menschlichen Gehirns, da diese Zellen aus einer anderen embryonalen Abstammungslinie stammen als Neuronen.
Während Mikroglia in einem späteren Stadium der Differenzierung zu Gehirnorganoiden hinzugefügt werden können, ist eine Methode erforderlich, um die Entwicklung des menschlichen Gehirns besser nachzuahmen. Die meisten anderen Protokolle fügen HPCs oder Mikroglia am Ende der zerebralen Organoidgenerierung hinzu. Wir erzeugen embryoide Körper aus gemischten iPSCs und HPCs vor der neuronalen Induktion.
Dies könnte die Entwicklung des menschlichen Gehirns besser nachahmen, da Mikroglia-Vorläufer sehr früh in der Entwicklung ins Gehirn wandern. Darüber hinaus spart die Verwendung von HPCs Zeit für die Differenzierung, da Mikroglia-Differenzierungsprotokolle oft über 30 Tage dauern. Daher kann unser Protokoll Zeit und Reagenzienkosten sparen.
Zu Beginn kultivieren Sie dissoziierte humaninduzierte pluripotente Stammzellen oder iPSCs in einer 12-Well-Platte, die einen Milliliter E8 Flex-Medium enthält, und inkubieren die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag überprüfen Sie die Völker unter dem Mikroskop und zählen die Anzahl der Völker, indem Sie alle Felder in einem Brunnen scannen. Ersetzen Sie das Medium durch einen Milliliter Medium A aus dem hämatopoetischen Kit.
Legen Sie die Platte für 48 Stunden zurück in den Inkubator. Am dritten Tag werden 500 Mikroliter des verbrauchten Mediums durch 500 Mikroliter frisches Medium A ersetzt und 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert. Beobachten Sie am nächsten Tag das Zellwachstum und die Differenzierung aus den iPS-Kolonien.
Ersetzen Sie das Medium durch einen Milliliter Medium B.Überwachen Sie die Zelldifferenzierung unter dem Mikroskop und führen Sie sechs bis sieben Tage lang jeden zweiten Tag einen halben Mediumwechsel mit 500 Mikrolitern Medium B durch. Beobachten Sie an Tag 10 das Vorhandensein heller einzelner runder Zellen mit der Morphologie normaler hämatopoetischer Vorläuferzellen (HPCs), die schwimmen oder lose an die flache Schichtzelle mit einigen losen Aggregaten gebunden sind. Sammeln Sie als Nächstes alle differenzierten HPCs, indem Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze dreimal auf und ab pipettieren.
Übertragen Sie die Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 300 g und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Medium B. Geben Sie 20 Mikroliter Zellsuspension in eine Zellzählkammer und zählen Sie die Zellen mit einem Zellmessgerät. Passen Sie die Zellkonzentration mit Medium B auf 1 Million Zellen pro Milliliter an.Die serielle Verdünnungskulturtechnik erzeugte eine angemessene Anzahl und Größe von iPSC-Kolonien, wobei die Kolonien am Ende der Kultur in Medium A signifikante morphologische Veränderungen zeigten.Nach drei Tagen in Medium B wurde eine HPC-Differenzierung mit dem Auftreten homogener runder Zellen beobachtet.
Am Tag 10 bildeten die HPCs überwiegend kolonieartige Cluster ohne nennenswerte Trümmer. Stellen Sie nach der Entnahme von HPCs, die sich von humanen iPSCs unterscheiden, sicher, dass die Kultur eines iPSC eine Konfluenz von 80 % erreicht hat. Geben Sie 500 Mikroliter Anti-Adhärenz-Spüllösung in eine Vertiefung der Mikrotiterplatte, um die Blasenbildung zu minimieren.
Drehen Sie die Platte fünf Minuten lang bei 2.000 g in einem schwingenden Schaufelrotor, der mit Plattenhaltern ausgestattet ist. Entfernen Sie die Spüllösung vollständig und waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit einem Milliliter DPBS und anschließend mit einem Milliliter DMEM/F-12, ohne Blasen zu bilden. Behandeln Sie die iPSCs mit einem Milliliter ACCUTASE-Lösung, um die Zelldissoziation zu initiieren.
Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop und notieren Sie Anzeichen einer Zelltrennung, während die Zellen am Boden haften bleiben. Ersetzen Sie die ACCUTASE-Lösung durch einen Milliliter DMEM/F-12-Medium und mischen Sie sie dann auf und ab, um die Zellen in einzelne Zellen zu dissoziieren. Übertragen Sie die dissoziierten Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie DMEM/F-12-Medium hinzu, um ein Endvolumen von fünf Millilitern zu erreichen.
Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 g und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter E8 Flex Medium. Zählen Sie die Zellen, um die Zellkonzentration auf 1 Million Zellen pro Milliliter im E8 Flex-Medium einzustellen. Mischen Sie anschließend iPSCs mit HPCs im Verhältnis zwei zu eins in die Vertiefung der Mikrotiterkulturplatte.
Geben Sie einen Mikroliter ROCK Inhibitor Y-27632 Stammlösung pro Milliliter Medium in den Überstand und schütteln Sie die Platte von Seite zu Seite. Drehen Sie die Platte fünf Minuten lang bei 300 g und beobachten Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen in den Mikrovertiefungen abgesetzt haben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.
Beobachten Sie nach 48 Stunden die Zellen unter dem Mikroskop auf die Bildung von Embryoidkörpern (EBs). Behandeln Sie anschließend eine 24-Well-Zellkulturplatte 15 Minuten lang mit 500 Mikrolitern Anti-Adhärenz-Spülpuffer, um eine Platte mit geringer Anhaftung zu erhalten. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit einem Milliliter DPBS und geben Sie jeweils einen Milliliter E8 Flex Medium in die Vertiefung.
Mit einer Pipettenspitze mit einer Öffnung von einem Milliliter resuspendieren Sie die EBs in der Mikrotiterplatte. Fügen Sie dann für jede Vertiefung der 24-Well-Platte mit geringer Anhaftung 100 Mikroliter Medium hinzu, das die EBs enthält. Inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.
Zu Beginn tauen Sie die Aliquots der Basalmembranmatrix 30 Minuten lang auf Eis auf. Am zweiten Tag nach der EB-Bildung geben Sie mit einer vorgekühlten 20-Mikroliter-Pipettenspitze 15 Mikroliter eiskalte Basalmembranmatrix in kleinen Tropfen auf das Medium, um die EBs zu beschichten. Stellen Sie die Platte für 48 Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.
Entfernen Sie am vierten Tag nach der EB-Bildung vorsichtig 500 Mikroliter Medium, ohne die EBs zu stören, und wiederholen Sie die Basalmembran-Matrix-Beschichtung wie zuvor gezeigt. Geben Sie dann 500 Mikroliter pluripotente Stammzellen mit neuronalem Induktionsmedium auf die Zellen. Stellen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius heißen und 5 % Kohlendioxid-Zelleninkubator.
Führen Sie am sechsten und achten Tag einen halben Mediumwechsel durch, indem Sie vorsichtig 500 Mikroliter Medium durch 500 Mikroliter frisches neuronales Induktionsmedium ersetzen. Führen Sie nach der Inkubation an den Tagen 10, 12 und 14 einen halben Mediumwechsel mit neuralem Stammzellmedium durch. Übertragen Sie am 15. Tag die gut enthaltenden Kugeln zusammen mit dem Medium in eine neue 12-Well-Platte, die mit Anti-Adhärenz-Spüllösung behandelt wurde.
Geben Sie 500 Mikroliter neuronales Reifungsmedium auf die Kultur. Überwachen Sie das Medium während der Reifephase auf Anzeichen von Nährstoffmangel, wie z. B. Farbveränderungen. Wenn ein Nährstoffmangel beobachtet wird, überführen Sie das Organoid auf eine Sechs-Well-Platte.
Ergänzen Sie das Reifungsmedium am 17. Tag sechs Tage lang mit Zytokinen, um die Reifung der Mikroglia zu erleichtern. Sammeln Sie schließlich an Tag 23 die resultierenden neuronalen Organoide zur Charakterisierung. Hochwertige HPC- und iPSC-Gemische bildeten innerhalb von 24 Stunden EBs, die ein kontinuierliches Wachstum und minimale Ablagerungen aufweisen.
Nach dem Transfer auf eine neue Platte wuchs EBS weiter, bis es ein Plateau im Reifemedium erreichte.
