WPS wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (CA129359), der Susan G. Komen for the Cure Foundation (BCTR0706967), das Department of Defense (BC084561) und der Seidman Cancer Center, unterstützt, während MKW durch einen unterstützt wurde Stipendium der American Cancer Society (PF-09-120-01). Zusätzliche Unterstützung für diese Arbeit wurde von der Case Center for Imaging Research, der Rechtssache Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703) und die Cystic Fibrosis Center (P30 DK027651) bereitgestellt.

Ein. Stabile Expression von CMV-Driven Renilla Luciferase <ol><li> Transfektion und Selektion eines stabilen klonale Population ist die bevorzugte Methode zur Expression dieses Renilla-Luciferase Reporter. Dieser Ansatz liefert eine konsistente und einheitliche Renilla Luciferase Expression nach der anschließenden Einführung von zusätzlichen sekundären Reporter-Konstrukte (zB Luciferase oder fluoreszierende Proteine). </li><li> Transfizieren malignen Zellen von Interesse mit dem Expressionsvektor kodiert Renilla-Luciferase, wie pcDNA3.1-Hygro oder einem anderen Plasmid, einen selektierbaren Marker. </li><li> Nach Transfektion, platzieren die Transfektanten unter einem optimierten Antibiotikumkonzentration mehrere Tage zu Wochen, um die Isolation von einzelnen Kolonien, die anschließend isoliert und werden einzeln subkultiviert erleichtern. </li><li> Wählen ≥ 10 einzelne Renilla-Luciferase-exprimierende Kolonien um das Ausmaß der Expression Renilla überwachen. </li><li&gt; Kolonien exprimieren hohe Mengen von Renilla-Luciferase werden anschließend analysiert funktionelle unterzogen, um sicherzustellen, dass die (i) pathophysiologischen Eigenschaften ihrer elterlichen Gegenstücke zurückgehalten werden, und (ii) Renilla Expressionswerte nicht abweichen oder mit der Zeit verändern. Diese Schritte sind unbedingt zu vermeiden, zu isolieren und zu studieren klonalen Varianten / Abweichler und eine ordnungsgemäße Integration der Renilla Konstrukt in das Genom zu validieren. </li><li> Sobald eine stabile Transfektanten wird isoliert und verifiziert, kann ein Entfernen der selektiven Druck und sichergestellt, daß die Expression von Renilla-Luciferase bleibt über längere Zeitspannen sowohl in vitro als auch in vivo konstant gehalten werden. </li></ol> 2. Expression, Auswahl und Functional Verification der induzierbaren Promoter-Driven Firefly Luciferase <ol><li> Subklonierung der Promotor von Interesse in eine pGL4-Luciferase Reporterplasmid beherbergen einen selektierbaren Marker (zB, puromycin), die sich von dem früher für stabile Renilla Ausdruck (zB Hygromycin) zu wählen ist. </li><li> Transfizieren malignen Zellen wie in Schritt I, und anschließend für eine stabile polyklonale Population von Glühwürmchen-Luciferase-exprimierenden Zellen auszuwählen. Da der Ort, an dem ein Bericht Gen integriert in das Genom fehlerhaften Auswirkungen auf die Expression und Regulation auslösen kann, ist es dringend empfohlen, für polyklonale Populationen von Glühwürmchen-Luciferase-exprimierenden Zellen auszuwählen, um klonalen Populationen im Gegensatz zu, dass (i) die Expression des Reportergens zu gewährleisten genauer widerspiegelt die des endogenen Gens in parentalen Zellen, und (ii) Integration Wirkungen auf die Genexpression werden gemittelt und über die heterogene Zellpopulation vermindert. </li><li> Bösartigen Zellen dazu entworfen, um stabil exprimieren sowohl Renilla und Glühwürmchen-Luciferasen werden kollektiv als Dual biolumineszierenden Reporter Zellen oder DBR Zellen bezeichnet. </li><li> Mit traditionellen &lt;em&gt; in vitro zellbasierten Assays Luciferasereportergens, ob die Zellen DBR Glühwürmchen-Luciferase Expression regulieren, entweder positiv oder negativ, in einer Weise, die in übereinstimmende mit parentalen Zellen transient mit diesen Vektoren transfiziert beobachtet. Ebenso sicher, dass CMV-driven Ausdruck Renilla nicht durch verschiedene Zell-Stimulation oder Behandlung Bedingungen geregelt. </li><li> Dazu Kultur DBR und parentalen Zellen in 24-Well-Platten, und anschließend transient co-transfizieren parentalen Zellen mit dem ursprünglichen CMV-Promotor und Renilla-Glühwürmchen-Konstrukte verwendet werden, um Zellen zu erzeugen DBR. </li><li> Danach behandeln DBR und transfizierten Zellen mit elterlichen Faktoren oder pharmakologische Wirkstoffe bekannt, die den Promotor von Interesse zu regulieren, und anschließend Quantifizieren Glühwürmchen-und Renilla-Lumineszenz unter Verwendung des Promega Dual-Luciferase Assay Kit. </li></ol> 3. Gründung 4T1 Primäre Mammatumoren <ol><li> Metastasierendem 4T1 Mammakarzinomzellen, dass wirwieder gefunden fehlender Adventitia Nager Pathogene wurden entwickelt, um stabil exprimieren, eine CMV-driven Renilla Luciferase (pcDNA3.1-CMV-Renilla Luciferase-hygro) und ein SBE-driven firefly Luciferase (pGL4.2-SBE-Luciferase-puro) als oben beschrieben. Orthotopen Engraftment dieser Brustkrebszellen führt zur Bildung von spontanen Metastasen hauptsächlich in der Lunge. </li><li> 4T1-Zellen sollten nicht zur Konfluenz während ihrer Ausbreitung in herkömmlichen 2-dimensionalen Gewebekultursystemen erreicht werden, und sie sollte einen Tag vor dem In-vivo-Impfung passagiert werden. </li><li> 4T1 Zellen sollten dissoziierten durch Trypsinisierung, gründlich in Wachstumsmedium und in PBS auf eine Konzentration von 2x10 5 Zellen / ml und sofort auf Eis gelagert. </li><li> Weibliche Balb / C-Mäuse (4-6 Wochen alt) sollte anästhesiert mit einer Induktion Dosis von 3% Isofluran und gehalten unter Anästhesie mit einer Dosis von 1% Isofluran. Bereiten Sie die Injektionsstelle durch Abtupfen mit70% igem Alkohol. Mit einer Pinzette vorsichtig greifen und heben Sie den vierten inguinal Mamma Pads. Vorsichtig, legen Sie ein 27,5-Gauge-Nadel Fase nach oben und injizieren in die Brustfettpolster direkt unter der Brustwarze, wobei besondere Sorgfalt nicht schieben die Nadel in die Bauchhöhle. Lassen Sie die Verschraubung und injizieren Sie langsam 50 ul der Zellsuspension (1x10 4 Zellen) in den Brustfettpolster. </li></ol> 4. Erste Dual-Luminescent Imaging <ol><li> Unmittelbar nach Transplantationszellen 4T1 Zellen auf die Brustfettpolster und während die Mäuse anästhesiert noch injizieren 100 ul RediJect Coelenterazin in die laterale Schwanzvene. Dies ist die optimale Substratkonzentration durch den Verkäufer und das beste von den Tieren vertragen empfohlen. </li><li> Unmittelbar platzieren Sie den Mauszeiger in die Isofluran Bugspitze im IVIS-200 Imaging-System und erwerben ein 0,5-1 Minuten lumineszierendes Bild. Effizienz zwischen Injektion und Bildaufnahme ist sehr wichtig, da das Signalfür Renilla-Luciferase fällt steil ~ 30 Sekunden nach der Injektion. Platzieren Sie die Maus wieder in seinem Käfig und lassen Sie es für ≥ 1 Stunde, was bedeutet, dass der restliche Renilla Luciferase-Signal verflüchtigt hat und dass die Maus vollständig aus der Narkose erholt sorgt erholen. </li><li> Verwalten 150 mg / kg D-Luciferin Kaliumsalz via IP-Injektion und 5 Minuten warten. Dies ist die optimale Konzentration von D-Luciferin, die eine stabile Lumineszenzsignal für 5-15 Minuten nach der Injektion in Versuchstieren bereitstellt. Anesthetize die Maus mit isoflourane und ersetzen in der IVIS-200, kümmert sich um das Tier in einer sehr ähnlichen Position in Bezug auf den ursprünglichen Renilla Akquisition positionieren. Die Gesamt-Intensität dieses Leuchtkäfer-Signal wird auf die Aktivität des Promotors von Interesse abhängen, und als solche, Visualisieren Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität kann die erweiterte Erfassungszeiten erfordern. </li><li> Mit dem IVIS Wohnfläche Image Software auf &quot;Photonen&quot;-Modus, stellen wertvollees sowohl für die Renilla und Glühwürmchen Akquisitionen als Mittel zur Grundlinie relativen Lumineszenz-Verhältnisse (RLR) herzustellen. </li></ol> 5. Longitudinal Luminescent Imaging <ol><li> 4T1 Zellen sind sehr aggressiv, so daß Inokulation von 1x10 4 Zellen führt typischerweise zu tastbaren Tumorbildung in 1 Woche und der Letalität der Tiere innerhalb von 4-5 Wochen. 4T1 Tumoren haben eine inhärente Tendenz ulcerate in Woche 4. Das Wachstum und die Wartung von ulzeriert Tumoren erfordern separate IACUC Zustimmung. Die 4T1 Tumor Studien gezeigt haben hierin durch die IACUC an der Case Western Reserve University genehmigt worden. </li><li> Wie oben beschrieben, sollte Mäusen injiziert RediJect Coelenterazin wöchentlich auf allgemeine Tumorwachstum und Metastasierung zu überwachen, als auch mit D-Luciferin zu Stoffwechselweg-spezifischen Signalisierung während verschiedener Stadien der Tumorentwicklung überwachen. Achten Sie darauf, jedes Mal, um sicherzustellen, das Renilla Luciferase-Signal vollständig vor dem Erwerb abgeführtder Glühwürmchen-Luciferase-Signal. </li><li> Als 4T1 Tumoren entwickeln und Fortschritte sollte Renilla-Luciferase Akquisitionen auf die anfänglichen Werte Renilla zum Zeitpunkt der Inokulation der Tumorzellen als Mittel zur Normalisierung und verfolgen Primärtumorwachstums gemessen normalisiert werden. Noch wichtiger ist, wird die Berechnung RLR Werte über die Zeit erstellt die zeitliche Regelung der einzelnen Signalanlagen in Bezug auf das Tumorwachstum und Progression. </li><li> Offene Lungenmetastasen wird innerhalb von 3-4 Wochen deutlich nach 4T1 Engraftment auf die Brustfettpolster. Vergleichen pulmonalen RLR Werte im Vergleich zu denen der Primärtumor berechnet stellt die räumliche Regulierung einzelner Signalsysteme relativ zu Tumorwachstum und Metastase. </li></ol> 6. Dual-Bioluminescent Imaging of Two Einzigartige Zelltypen in einem einzigen Tier <ol><li> Ingenieur ein Brustkrebs-Zelllinie, stabil Expression CMV-gesteuerte Renilla-Luciferase, wie oben beschrieben. Wiederholen Sie diesen VorgangEngineering-Prozess unter Verwendung CMV-gesteuerte Glühwürmchenluciferase auf einer zweiten unterschiedlichen Brustkrebszellinie. </li><li> Hier beschreiben wir gemischten Renilla-Luciferase-exprimierenden 4T1 Zellen mit ihren metastatischen und isogenen Glühwürmchen-Luciferase-exprimierenden 4T07 Gegenstücken 10, 11. Unterschiedliche Verhältnisse von diesen gemischten Brustkrebs Zellpopulationen werden anschließend in das Brustfettpolster wie oben beschrieben injiziert. </li><li> Unmittelbar erwerben sowohl Glühwürmchen und Renilla Luciferase Bilder anfänglichen RLRS Vertreter einer bestimmten beimpft Zellgemisch etablieren. </li><li> Längs dualen biolumineszierenden Bildgebung visualisieren und Verfolgung von Änderungen in der zellulären Zusammensetzung innerhalb des primären Tumors als auch die Metastasierung von raumzeitlichen jeder Brustkrebs-Derivat, bezogen auf das Tumorwachstum und die Progression. </li><li> Alternativ können einzelne Brustkrebs Zellpopulationen in verschiedenen Orten in der Maus inokuliert (dh die rechte und linke abdominalen Euterfett Pads)die systemischen Einflüsse beurteilen diese beiden Populationen aufweisen übereinander während verschiedener Stufen des Tumorwachstums und der Metastasierung. </li></ol> 7. Repräsentative Ergebnisse: Eine große Stärke der Dual-Biolumineszenz-Bildgebung liegt in der Tatsache, dass jedes Bild in sich konsistent und kontrolliert, so dass die kontinuierliche Signale aus dem Primärtumor Funktion als wichtige Kennzahl abgeleitet, um die gesamte Erfolg oder Misserfolg eines jeden Renilla und Glühwürmchen Übernahme abzuschätzen ist. Dieser Aspekt der bildgebenden Verfahren ist besonders wichtig während Akquisitionen der Aktivität von Renilla-Luciferase, dessen Substrat Coelenterazin sehr oxidationsempfindlich, die zu der Fähigkeit zum automatischen Lumineszenz. 1A zeigt ein Beispiel für diese Nebenwirkung, die sofort manifestiert sich als unspezifische lumineszierenden Signale aus dem Darmtrakt, nicht der etablierte Primärtumor stammt. Normalerweise meldet diese unspezifischen Coelenterazine transpire nach gescheiterter intravenöse Injektionen von diesem Renilla Luciferase Substrat. Sobald jedoch robuste primären tumorderivierten Renilla Signale erhalten wurden (1B, linkes Bild), ist es sicher, einzufangen Stoffwechselweg-spezifischen Signalisierung Messungen von bildgebenden Glühwürmchen-Luciferase (1B, rechtes Feld), dessen D-Luciferin abgeleitet vorgehen Substrat ist sehr stabil auf IP-Injektion und produziert vernachlässigbar geringen Pegeln von Hintergrund auto-Lumineszenz. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3245/3245fig1.jpg" /> Abbildung 1. Acquiring Renilla und Glühwürmchen stammenden biolumineszierenden Bilder in vivo RLRS berechnen. (A) Ein Beispiel für einen fehlgeschlagenen IV Injektion von Coelenterazin wodurch unspezifische Signal aus dem Darmtrakt. Kreis und PT den ungefähren Standort des Primärtumors. (B) Eine erfolgreiche Renilla Erwerb einer Maus 4T1 ein Primärtumor und p tragendenulmonary Metastasen (links; 4WK nach Fettpolster Transplantation). Die entsprechende firefly Akquisition ermöglicht für die Berechnung der RLRS sowohl aus dem primären Tumor und seine Lungenmetastasen. (C) Grafische Darstellung des Primärtumors und Lungenmetastasen RLRS von Mäusen in Panel B gezeigt (n = 4) berechnet.

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Biomed. Opt. 13, 054035-054035 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die absolute Macht der Biolumineszenz Bildgebung liegt in ihrer Fähigkeit, das Tumorwachstum und Metastasierung in komplexe Längsschnittstudien, die hierin beinhalteten die Verwendung von aggressiven 4T1 Brustkrebszellen zu quantifizieren. Da diese Verfahren für die stabile Integration der beiden Luciferase-Reporter-Konstrukte verlassen, können diese Techniken leicht angepasst werden und translatiert zu anderen Krebs-Zelllinien unterschiedlicher Tumor Latenzen und metastatischen Fähigkeiten. Ähnlich wie bei den hier gezeigten Ergebnisse, Berechnen spezifischen RLRS innerhalb langsam entwickelnden Primärtumoren und ihre eventuelle Metastasen ermöglicht die Echtzeit raumzeitlichen Identifizierung spezifischer Signalisierungsereignisse, die während des metastatischen Progression von Tumoren unabhängig von ihrer Dauer der Latenz durchsickern. Nach Identifizierung spezifischer Promotor regulatorischen Fall ist es wichtig, sowohl die primäre verbrauchsteuerpflichtigen Tumor und dessen metastatischen Läsionen für die Erfüllung der Norm immunhistochemischen und differential Genexpressionsanalysen zu überprüfen ähnliche Regelung des endogenen Gens und / oder Protein. Technisch gesehen, die wichtigste Herausforderung der dualen Biolumineszenz Analysen liegt in der relativ kurzen Dauer der Renilla Luciferase Signale. Als solches erfordert dieses Bildgebungstechnik signifikante Optimierung der Schwanzvene Einspritzvorgang sowie die sofortige Bildgebung von einzeln injiziert Tiere, ein Prozess, zeitaufwändig und ineffizient etwas relativ zur Bildgebung Glühwürmchen-Luciferase ist. Kürzlich führte Promega &quot;Viviren&quot;, die eine zweite Generation Luciferase Substrat, dessen Seiten der Oxidation werden durch Veresterung bis zu diesem Molekül Gewinne Eintritt in Zellen, an welchem ​​Punkt das Molekül schnell entesterten blockiert darstellt. Zusammengenommen diese neuartige Substrat wirksam senkt automatischen Lumineszenz und unspezifische Modifikation und / oder Abbau der mit Renilla-induzierten Lumineszenz auto-12. Dabei diese neue renilla Luciferasesubstrat produziert hellere lumineszierende Signale, aber die übermäßige Kosten, die mit dem Erwerb und der Verwendung von &quot;Viviren&quot; zugeordnet haben relativ wenige Studien notwendig, um den Gesamtnutzen dieses Substrats im Dual Biolumineszenz Analysen auszuwerten vorgesehen. Schließlich ist die Sensitivität jedes biolumineszierenden Assay entscheidend von der CCD-Kamera in operanten Erwerbs einzelner Lichteinheiten. In der Tat, wie diese Technologien zu verbessern, sehen wir einen Punkt in der Zukunft, in der unsere Fähigkeit, komplexe Licht-vermittelte Biolumineszenzreaktionen visualisieren schwitzen effizient kann in frei beweglichen Tieren 13.

<table border="1"><tbody><tr><th> Namen Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> pGL4.2-Puro [luc2 / Puro] Vector </td><td> Promega </td><td> E6751 </td></tr><tr><td> Glomax Mult-idection System </td><td> Promega </td><td></td></tr><tr><td> IVIS 200 Serie </td><td> Caliper Life Sciences </td><td></td></tr><tr><td> Dual-Luciferase-Reporter-Assay-System </td><td> Promega </td><td> E1960 </td></tr><tr><td> Rediject Coelenterazin-h </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 760506 </td></tr><tr><td> D-Luciferin K-Salz </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 122796 </td></tr></tbody></table>

in vivo dual substrate bioluminescent imaging

Unser Verständnis von, wie und wann Brustkrebszellen Transit von etablierten primären Tumoren Metastasen hat zu einem außergewöhnlichen Wert seit dem Aufkommen der in vivo Biolumineszenz Imaging-Technologien 1-3 erhöht. Tatsächlich ist die Fähigkeit, zu lokalisieren und zu quantifizieren Tumorwachstum längs in einer einzigen Gruppe von Tieren zum Abschluss der Studie nach opfern einzelnen Tiergruppen zu bestimmten Assayzeiten revolutioniert wie Forscher Brustkrebsmetastase untersuchen entgegengesetzt. Leider verhindern derzeitigen Methoden die Echtzeit-Bewertung kritischer Veränderungen, die in Zell-Signalisierungssysteme, wie Brustkrebszellen (i) innerhalb von primären Tumoren entwickeln, (ii) durch den Körper zu verbreiten, und (iii) reinitiate proliferativen Programme an Stellen von ein transpire metastatischen Läsion. Neuere Fortschritte in der bildgebenden biolumineszierenden machen es nun möglich, gleichzeitig Quantifizierung spezifischer spatiotemporal Veränderungen in der Genexpression in Abhängigkeit von der Entwicklung von Tumoren und metastatischen Progression durch die Verwendung der dualen Substrat Lumineszenzreaktionen. Um dies zu tun, nehmen die Forscher Vorteil für zwei Licht erzeugende Luciferase Enzyme aus der Glühwürmchen (Photinus pyralis) und Meer Stiefmütterchen (Renilla reniformis), von denen beide sich gegenseitig ausschließende Substrate, die zuvor ihre weite Verbreitung in erleichtert in vitro Zelle reagieren isoliert basierenden Reportergenassays 4. Hier zeigen wir, die in vivo Nützlichkeit dieser beiden Enzyme so dass einer Lumineszenzreaktion spezifisch markiert die Größe und Lage eines Entwicklungsmittels Tumors, während die zweite Lumineszenzreaktion dient als Mittel, um den Aktivierungsstatus spezifischer Signalsysteme während verschiedene Stadien der Tumor visualisieren und Metastasierung Entwicklung. Somit sind die Ziele dieser Studie zwei-fach. Zunächst beschreiben wir die notwendigen Schritte zur Dual-Biolumineszenz Reporter-Zelllinie zu konstruierens, als auch solche benötigt wird, um ihre Verwendung bei der Visualisierung der Raumzeit-Regulation der Genexpression während bestimmter Stufen des metastatischen Kaskade erleichtern. Verwendung des Modells der 4T1 Brustkrebsmetastase zeigen wir, dass die in vivo-Aktivität eines synthetischen Smad Bindungselements (SBE) Promotor wurde dramatisch verringerte Lungenmetastasen zu derjenigen im Primärtumor 4-6 gemessenen verglichen. Kürzlich wurde gezeigt Brustkrebsmetastase durch Veränderungen in der primären Tumor-Mikroumgebung und reaktiven Stroma, einschließlich derjenigen auftretenden Fibroblasten und Infiltrieren Immunzellen 7-9 geregelt werden. Somit wird unserem zweiten Ziel sein, die Nützlichkeit von dualen biolumineszierenden Techniken in die Überwachung des Wachstums und Lokalisierung von zwei einzigartige Zellpopulationen in einem einzigen Tier während das Wachstum von Brustkrebs und Metastasen beherbergten demonstrieren.

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In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Hier beschreiben wir die Methoden zu konstruieren, zu visualisieren und zu quantifizieren Biolumineszenzreaktionen sowohl Glühwürmchen und Renilla Luciferase Enzymen bei metastasierendem Brustkrebs-Zellen während deren Wachstum und Metastasierung ausgedrückt<em&gt; In vivo</em&gt;.

In vivo Dual-Substrat Bioluminescent Imaging

Our understanding of how and when breast cancer cells transit from established primary tumors to metastatic sites has increased at an exceptional rate ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

15.4K Aufrufe.  Case Western Reserve University. Hier beschreiben wir die Methoden zu konstruieren, zu visualisieren und zu quantifizieren Biolumineszenzreaktionen sowohl Glühwürmchen und Renilla Luciferase Enzymen bei metastasierendem Brustkrebs-Zellen während deren Wachstum und Metastasierung ausgedrückt In vivo.

Serie: In vivo Dual Substrate Bioluminescent Imaging

Murine Bioluminescent Hepatic Tumour Model

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are administered specifically to the liver to induce a localised liver tumour, via mobilisation of the spleen and splitting into two, leaving intact the vascular pedicle for each half of the spleen. Lewis lung carcinoma cells that constitutively express the firefly luciferase gene (luc1) are inoculated into one hemi-spleen which is then resected 10 minutes later. The other hemi-spleen is left intact and returned to the abdomen. Liver tumour growth can be monitored by bioluminescence imaging using the IVIS whole body imaging system. Quantitative imaging of tumour growth using IVIS provides precise quantitation of viable tumour cells. Tumour cell death and necrosis due to drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This mouse model allows for investigating the mechanisms underlying metastatic tumour-cell survival and growth and can be used for the evaluation of therapeutics of liver metastasis. 

This article describes a procedure for the induction of orthotopic bioluminescent liver tumours in mice, and subsequent analysis of tumour growth confined to the liver using live whole body luminescence imaging.

Murine Bioluminescent Leber Tumor-Modell

This video describes the establishment of liver metastases in a mouse model that can be subsequently analysed by bioluminescent imaging. Tumour cells are ...

Forschung

Medizin

Dual-mode Imaging of Cutaneous Tissue Oxygenation and Vascular Function

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health disorders such as chronic wounds. We report the development of a dual-mode imaging system for non-invasive and non-contact imaging of cutaneous tissue oxygenation and vascular function. The imaging system integrated an infrared camera, a CCD camera, a liquid crystal tunable filter and a high intensity fiber light source. A Labview interface was programmed for equipment control, synchronization, image acquisition, processing, and visualization. Multispectral images captured by the CCD camera were used to reconstruct the tissue oxygenation map. Dynamic thermographic images captured by the infrared camera were used to reconstruct the vascular function map. Cutaneous tissue oxygenation and vascular function images were co-registered through fiduciary markers. The performance characteristics of the dual-mode image system were tested in humans.

A dual-mode imaging system was developed for non-contact assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function.

Dual-Mode-Imaging von Hautgewebe Oxygenation und Gefäßfunktion

Accurate assessment of cutaneous tissue oxygenation and vascular function is important for appropriate detection, staging, and treatment of many health ...

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The cell line was originally induced by intracranial injection of 3-methyl-cholantrene into a C57BL/6 syngeneic mouse strain 1; therefore, immunologically competent C57BL/6 mice can be used. While we use GL261, the following protocol can be used for the implantation and monitoring of any intracranial mouse tumor model. GL261 cells were engineered to stably express firefly luciferase (GL261-luc). We also created the brighter GL261-luc2 cell line by stable transfection of the luc2 gene expressed from the CMV promoter. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mice (albino variant of C57BL/6) from the National Cancer Institute, Frederick, MD were used to eliminate the light attenuation caused by black skin and fur. With the use of albino C57BL/6 mice; in vivo imaging using the IVIS Spectrum in vivo imaging system is possible from the day of implantation (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). The GL261-luc and GL261-luc2 cell lines showed the same in vivo behavior as the parental GL261 cells. Some of the shared histological features present in human GBMs and this mouse model include: tumor necrosis, pseudopalisades, neovascularization, invasion, hypercellularity, and inflammation 1.
Prior to implantation animals were anesthetized by an intraperitoneal injection of ketamine (50 mg/kg), xylazine (5 mg/kg) and buprenorphine (0.05 mg/kg), placed in a stereotactic apparatus and an incision was made with a scalpel over the cranial midline. A burrhole was made 0.1mm posterior to the bregma and 2.3mm to the right of the midline. A needle was inserted to a depth of 3mm and withdrawn 0.4mm to a depth of 2.6mm. Two &mu;l of GL261-luc or GL261-luc2 cells (107 cells/ml) were infused over the course of 3 minutes. The burrhole was closed with bonewax and the incision was sutured.
Following stereotactic implantation the bioluminescent cells are detectable from the day of implantation and the tumor can be analyzed using the 3D image reconstruction feature of the IVIS Spectrum instrument. Animals receive a subcutaneous injection of 150&mu;g luciferin /kg body weight 20 min prior to imaging. Tumor burden is quantified using mean tumor bioluminescence over time. Tumor-bearing mice were observed daily to assess morbidity and were euthanized when one or more of the following symptoms are present: lethargy, failure to ambulate, hunched posture, failure to groom, anorexia resulting in &gt;10% loss of weight. Tumors were evident in all of the animals on necropsy.

Intracranial Implantation with Subsequent 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of Murine Gliomas

Intracranial implantation of GL261 cells into C57BL/6 mice produces malignant gliomas that recapitulate many of the hallmarks of human glioblastoma multiforme. We used GL261 cells stably expressing luciferase to allow us to use in vivo imaging to follow tumor progression. The surgery and 3D in vivo imaging are demonstrated.

Intrakranielle Implantation mit anschließender 3D In Vivo Bioluminescent Imaging von Murine Gliome

The mouse glioma 261 (GL261) is recognized as an in vivo model system that recapitulates many of the features of human glioblastoma multiforme (GBM). The ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotaktische Intrakranielle Implantation und<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging der Tumorxenotransplantaten in einem Maus-Modell-System des Glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite fluorescent in situ elements through the optical fibers, and then record some of the emitted photons, via the same optical fibers. The light source is a laser that sends the exciting light through an element within the fiber bundle and as it scans over the sample, recreates an image pixel by pixel. As this scan is very fast, by combining it with dedicated image processing software, images in real time with a frequency of 12 frames/sec can be obtained.
We developed a technique to quantitatively characterize capillary morphology and function, using a confocal fluorescence videomicroscopy device. The first step in our experiment was to record 5 sec movies in the four quadrants of the tumor to visualize the capillary network. All movies were processed using software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Paris France) that performs an automated segmentation of vessels around a chosen diameter (10 &mu;m in our case). Thus, we could quantify the 'functional capillary density', which is the ratio between the total vessel area and the total area of the image. This parameter was a surrogate marker for microvascular density, usually measured using pathology tools.
The second step was to record movies of the tumor over 20 min to quantify leakage of the macromolecular contrast agent through the capillary wall into the interstitium. By measuring the ratio of signal intensity in the interstitium over that in the vessels, an 'index leakage' was obtained, acting as a surrogate marker for capillary permeability.

In vivo Imaging of Tumor Angiogenesis using Fluorescence Confocal Videomicroscopy

In this paper, we present a method to analyze tumor microvessels in vivo using dynamic contrast-enhanced fluorescence videomicroscopy. Two quantitative parameters were acquired: functional capillary density reflecting the vascularity of the tumor, and index leakage reflecting the leakiness of the endothelial wall.

In-vivo-Imaging der Tumorangiogenese mit Fluoreszenz-Videomikroskopie Konfokale

Fibered confocal fluorescence in vivo imaging with a fiber optic bundle uses the same principle as fluorescent confocal microscopy. It can excite ...

Bioluminescent Orthotopic Model of Pancreatic Cancer Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%. New therapeutic options are critically needed and depend on improved understanding of pancreatic cancer biology. To better understand the interaction of cancer cells with the pancreatic microenvironment, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression. Luciferase-tagged pancreatic cancer cells are resuspended in Matrigel and delivered into the pancreatic tail during laparotomy. Matrigel solidifies at body temperature to prevent leakage of cancer cells during injection. Primary tumor growth and metastasis to distant organs are monitored following injection of the luciferase substrate luciferin, using in vivo imaging of bioluminescence emission from the cancer cells. In vivo imaging also may be used to track primary tumor recurrence after resection. This orthotopic model is suited to both syngeneic and xenograft models and may be used in pre-clinical trials to investigate the impact of novel anti-cancer therapeutics on the growth of the primary pancreatic tumor and metastasis.

Improved understanding of pancreatic cancer biology is critically needed to enable the development of better therapeutic options to treat pancreatic cancer. To address this need, we demonstrate an orthotopic model of pancreatic cancer that permits non-invasive monitoring of cancer progression using in vivo bioluminescence imaging.

Bioluminescent orthotopen Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs Progression

Pancreatic cancer has an extremely poor five-year survival rate of 4-6%.  New therapeutic options are critically needed and depend on improved ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the pathophysiological role of neuroplasticity in GI disorders remains unknown. Novel experimental models which allow simulation and modulation of GI neuroplasticity may enable enhanced appreciation of the contribution of neuroplasticity in particular GI diseases such as pancreatic cancer (PCa) and chronic pancreatitis (CP). Here, we present a protocol for simulation of pancreatic neuroplasticity under in vitro conditions using newborn rat dorsal root ganglia (DRG) and myenteric plexus (MP) neurons. This dual-neuron approach not only permits monitoring of both organ-intrinsic and -extrinsic neuroplasticity, but also represents a valuable tool to assess neuronal and glial morphology and electrophysiology. Moreover, it allows functional modulation of supplied microenvironmental contents for studying their impact on neuroplasticity. Once established, the present neuroplasticity assay bears the potential of being applicable to the study of neuroplasticity in any GI organ.

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuronal plasticity is an increasingly recognized, but insufficiently understood feature of the gastrointestinal (GI) tract. Here, in the example of human pancreatic disorders, we present an in vitro neuroplasticity assay for the study of neuronal plasticity in the GI tract at both morphological and functional level.

Simulation von Bauchspeicheldrüsenneuroplastizität:<em&gt; In-vitro-</em&gt; Zwei-Neuron-Plastizität Assay

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an increased risk of vascular morbidity.&#160;Yet, albeit&#160;the mounting clinical evidence, there is a paucity of clear studies of vascular toxicity and therefore the etiology of a heterogeneous group of vascular/cardiovascular disorders remains to be elucidated. Moreover, the mechanism that may underlie vascular toxicity can completely differ from the principles of chemotherapy-induced cardiotoxicity, which is related to direct myocyte injury. We have established a real-time, in vivo molecular imaging platform&#160;to evaluate&#160;the potential&#160;acute&#160;vascular toxicity of anti-cancer therapies.
We have set up a platform of in vivo, high-resolution molecular imaging&#160;in mice,&#160;suitable for visualizing vasculature within confined organs and reference blood vessels within the same individuals whereas each individual serve as its own control. Blood vessel walls were impaired after doxorubicin administration, representing a unique mechanism of vascular toxicity that may be the early event in end-organ injury. Herein, the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging is described, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapy-induced Vascular Toxicity - Real-time In vivo Imaging of Vessel Impairment

We herein describe the method of fibered confocal fluorescent microscopy (FCFM) based imaging, which provides an innovative mode to understand physiological phenomena at the cellular and sub-cellular levels in animal subjects.

Chemotherapie-induzierte vaskuläre Toxizität - Echtzeit-<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von Vessel Impairment

Certain classes of chemotherapies may exert acute vascular changes that may progress into long-term conditions that may predispose the patient to an ...