Bu tahlil, öğrencinin boncukları farklı embriyo bölgelerine implante ederek hücre farklılaşması ve morfogenez gibi birçok gelişimsel süreçte spesifik moleküllere bakmasını sağlar. Bu protokol, organoidler de dahil olmak üzere herhangi bir deneysel hayvan modeline, hücre kültürüne, organotipik modele uygulanabilir. Ayrıca, öğrencilere temel gelişim biyolojisini öğretmek için yararlı bir eğitim aracıdır.
Prosedürü gösteren, laboratuvardan bir lisans öğrencisi olan Alexandra Gonzales-Gonzales olacak. Başlamak için, döllenmiş beyaz Leghorn tavuk yumurtalarını, nemlendirilmiş bir inkübatörde 38 santigrat derece ve% 70 bağıl nemde sivri uçlu tarafı aşağı bakacak şekilde dikey olarak inkübe edin. 28. aşamaya ulaştıklarında, Hamburger ve Hamilton'a göre, yumurtaları inkübatörden çıkarın,% 70 etanol ile değiştirin ve havanın kurumasını sağlayın.
Daha sonra çalışma alanını, mikroskopları ve aletleri% 70 etanol ile dezenfekte edin. Daha sonra, kan damarlarını tanımlamak ve embriyoyu bulmak için yumurtaları mumlayın. Embriyosu olmayan yumurtaları atın.
Dişsiz forsepslerin ucunu kullanarak, bir yumurtanın kör ucuna dokunarak bir pencere açın ve bir santimetrekarelik bir kabuk bölümünü çıkarın. Ardından, yumurtayı bir karton veya plastik tutucuya aktarın ve stereo mikroskop altına yerleştirin. İnce cerrahi forseps kullanarak, embriyoya temas edebilecek küçük yumurta kabuğu parçalarını çıkarın ve hava zarını delerek ve çekerek çıkarın.
Daha sonra, ince cerrahi forseps kullanarak, koryoallantoik membranın vaskülatürününe zarar vermemeye dikkat ederek amniyotik çuvalı hafifçe yırtın. İstenilen aşamada olup olmadıklarını belirlemek için embriyoları ovo-in-ovo olarak sahneleyin. Affi-jel heparin boncuk hazırlığı için, 45 milimetrelik bir Petri kabına sığacak şekilde kare şeklinde bir parafilm bölümü kesin.
Parafilmi Petri kabının dibine yerleştirdikten sonra, dişsiz forsepslerin ucunu kullanarak, her köşeyi itin ve kabın dibine sabitleyin. Daha sonra, bir pipet veya spatula kullanarak, boncukları bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve süpernatanın yerleşmesine ve pipetlenmesine izin vererek PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, bir mikro pipet kullanarak, 40 ila 50 boncuğu parafilm kaplı Petri kabının merkezine aktarın.
Mikroskop altında, 100 mikrometre çapına sahip 30 Affi-jel veya heparin boncuk seçin. Referans olarak 28 aşamalı bir embriyonun üçüncü bir ara basamağını kullanarak boncukları boyutlandırın. Boncuk, interdigit'ten daha küçük olmalıdır.
Seçilen boncukları çevreleyen fazla PBS'yi dikkatlice çıkardıktan sonra, bunları tedavi çözeltisinin iki ila beş mikrolitresine batırın. Çözeltideki boncukları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçka sırasında, boncukların kurumasını önlemek için, yerel atmosferi nemlendirmek ve buharlaşmayı yavaşlatmak için çanağı parafilm ile örtmek için boncukların etrafına birkaç damla PBS veya su pipetin.
AG1X2 boncuk hazırlığını dökün. Boncukları bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için spatulayı kullanın ve istenen son konsantrasyonda 50 mikrolitre arıtma çözeltisi ekleyin. Tüpleri ışıktan korumak için folyo ile sardıktan sonra, boncukları yavaş sallayarak 20 dakika boyunca inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, bir pipet kullanarak, bir girdapta hafif ajitasyon ile iki dakika boyunca suda çözünmüş% 0.2 fenol kırmızısı ile leke içinde mümkün olduğunca fazla arıtma çözeltisini çıkarın. Boyama işleminden sonra boyayı çıkarın, ardından kalan boyayı çıkarmak için boncukları PBS'de iki kez yıkayın. Daha sonra, bir mikro pipet ucu kullanarak, 40 ila 50 AG1X2 boncuğu paraform kaplı Petri kabının merkezine aktarın ve boncukları beş mikrolitre PBS'ye batırın.
Daha sonra mikroskop altında, 100 mikrometre çapında yaklaşık 30 boncuk seçin. Yerel atmosferi nemlendirmek için seçilen boncukları deneysel çözeltiye birkaç damla PBS veya boncukların etrafına su ile batırın. Buharlaşmayı yavaşlatmak için kabı parafilm ile örtün.
Embriyoları manipüle etmeden önce, bir tezgah üstünde yan yana iki stereo mikroskop yerleştirin. Daha sonra, dişsiz forseps kullanarak, kalan yumurtalarda bir pencere oluşturun. Daha sonra, mikroskop altında, sağ arka bacağın yakınındaki amniyotik zarı ince cerrahi forseps ile yırtın.
İnce forseps kullanarak, sağ arka bacağı ortaya çıkarmak için embriyoyu amniyotik zardan tutun. Daha sonra ince bir Tungsten iğnesi kullanarak, arka bacağın üçüncü iç basamağının ditimate'sinde ortalanmış bir delik açın. Embriyoyu ve maruz kalan arka bacağı serbest bırakmadan, forsepsin uçlarından birini kullanarak diğer mikroskoptan tedavi edilmiş bir boncuk alın.
Forsepsler, bir boncuğun ucuna yapışması için açık olmalıdır. Boncuğu arka bacağın yakınındaki civciv embriyosuna aktarın ve rakamlar arası deliğin üzerine yerleştirin. forsepsleri deliğe girene kadar kapatarak boncuk üzerine baskı uygulayın.
Daha sonra embriyoyu serbest bırakın, yumurta kabuğu penceresini bantla kapatın ve yumurtaları gerekli aşamaya ulaşana kadar inkübatöre geri verin. Tahlil etkinliğini sağlamak için, boncuk tutarlı ve hassas bir şekilde doğru yere yerleştirilmelidir. Bu çalışmada, ıslatılmış boncuk, apikal ektodermal sırtın altındaki üçüncü ara hanenin distalmost içine yerleştirilmiştir.
Embriyolar, iskelet elemanlarının oluşumunu kanıtlamak ve hücre farklılaşması üzerindeki etkileri değerlendirmek için okyanus mavisi ve alizarin kırmızısı ile boyanabilir. Bu tahlil aynı zamanda nötr kırmızı ve gen regülasyonu ile hücre ölümünü değerlendirmek, C2 hibridizasyonunu satın almak için de çok uygundur. Bu deneysel aracın temel avantajı, ıslatılmış boncukların zamanını ve yerini kontrol etmektir.
Çekirdek konumlandırmayı hassas gelişimsel zamanlama ile birleştirmek, hücre farklılaşma süreçlerini incelemek için muazzam olanaklar sağlar.
