Ce test permet à l’étudiant d’examiner des molécules spécifiques dans de nombreux processus de développement, tels que la différenciation cellulaire et la morphogenèse en implantant les perles dans des régions embryonnaires distinctes. Ce protocole peut être appliqué à tous les modèles animaux expérimentaux, à la culture cellulaire, aux modèles organotypiques, y compris les organoïdes. De plus, c’est un outil éducatif utile pour enseigner la biologie fondamentale du développement aux étudiants.
Alexandra Gonzales-Gonzales, une étudiante de premier cycle du laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, incubez les œufs de poule blancs de Livourne fécondés verticalement avec le côté pointu vers le bas dans un incubateur humidifié à 38 degrés Celsius et 70% d’humidité relative. Une fois qu’ils atteignent le 28e stade, selon Hamburger et Hamilton, retirez les œufs de l’incubateur, échangez-les avec de l’éthanol à 70% et laissez-les sécher à l’air.
Désinfectez ensuite la zone de travail, les microscopes et les instruments avec de l’éthanol à 70%. Ensuite, allumez les œufs pour identifier les vaisseaux sanguins et localiser l’embryon. Jetez les œufs qui n’ont pas d’embryon.
À l’aide de l’extrémité d’une pince non dentée, ouvrez une fenêtre en tapotant l’extrémité émoussée d’un œuf et retirez une section de coquille d’un centimètre carré. Ensuite, transférez l’œuf dans un support en carton ou en plastique et placez-le sous le stéréomicroscope. À l’aide de pinces chirurgicales fines, retirez tout petit morceau de coquille d’œuf qui pourrait entrer en contact avec l’embryon et retirez la membrane de l’air en la perforant et en la tirant.
Ensuite, à l’aide de pinces chirurgicales fines, déchirez légèrement le sac amniotique, en veillant à ne pas endommager le système vasculaire de la membrane chorioallantoïque. Mettez en scène les embryons in-ovo pour déterminer s’ils sont au stade souhaité. Pour la préparation de perles d’héparine Affi-gel, coupez une section de parafilm de forme carrée pour l’adapter à une boîte de Petri de 45 millimètres.
Après avoir placé le parafilm sur le fond de la boîte de Pétri, à l’aide de l’extrémité de pinces non dentées, poussez chaque sommet et fixez-le au fond de la boîte. Ensuite, à l’aide d’une pipette ou d’une spatule, transférez les billes dans un tube de microcentrifugation et lavez-les deux fois avec du PBS en leur permettant de déposer et de pipeter le surnageant. Ensuite, à l’aide d’une micro pipette, transférez 40 à 50 perles au centre de la boîte de Petri recouverte de parafilm.
Au microscope, sélectionnez 30 billes d’Affi-gel ou d’héparine d’un diamètre de 100 micromètres. Dimensionnez les perles en utilisant un troisième interdigit d’un embryon de 28 stades comme référence. La perle doit être plus petite que l’interdigit.
Après avoir soigneusement retiré l’excès de PBS entourant les billes sélectionnées, faites-les tremper dans deux à cinq microlitres de la solution de traitement. Incuber les billes dans la solution pendant 30 minutes à température ambiante. Pendant l’incubation, pour éviter que les perles ne se dessèchent, pipettez quelques gouttes de PBS ou d’eau autour des perles pour humidifier l’atmosphère locale et recouvrez le plat de parafilm pour ralentir l’évaporation.
Versez la préparation des billes AG1X2. Utilisez la spatule pour transférer les billes dans un tube de microcentrifugation et ajoutez 50 microlitres de la solution de traitement à la concentration finale souhaitée. Après avoir enveloppé les tubes avec du papier d’aluminium pour les protéger de la lumière, incuber les perles pendant 20 minutes en les agitant lentement.
Après l’incubation, à l’aide d’une pipette, retirer autant que possible de la solution de traitement dans la teinture avec 0,2% de rouge phénol dissous dans l’eau pendant deux minutes avec une légère agitation dans un vortex. Après la coloration, retirez le colorant, puis lavez les perles deux fois dans du PBS pour éliminer tout colorant résiduel. Ensuite, à l’aide d’une pointe de micro pipette, transférez 40 à 50 perles AG1X2 au centre de la boîte de Petri recouverte de paraforme et faites tremper les perles dans cinq microlitres de PBS.
Ensuite, sous un microscope, sélectionnez environ 30 perles de 100 micromètres de diamètre. Immergez les perles sélectionnées dans la solution expérimentale avec quelques gouttes de PBS ou d’eau autour des perles pour humidifier l’atmosphère locale. Couvrir le plat avec un parafilm pour ralentir l’évaporation.
Avant de manipuler les embryons, disposez deux stéréomicroscopes l’un à côté de l’autre sur une paillasse. Ensuite, à l’aide de pinces non dentées, créez une fenêtre dans les œufs restants. Ensuite, au microscope, déchirez la membrane amniotique près du membre postérieur droit avec une pince chirurgicale fine.
À l’aide d’une pince fine, maintenez l’embryon par la membrane amniotique pour exposer le membre postérieur droit. Ensuite, à l’aide d’une fine aiguille en tungstène, faites un trou centré dans le plus distal du troisième interdigit du membre postérieur. Sans libérer l’embryon et le membre postérieur exposé, prenez une perle traitée de l’autre microscope à l’aide de l’une des pointes de la pince.
La pince doit être ouverte pour qu’une perle adhère à son extrémité. Transférez la perle dans l’embryon de poussin près du membre postérieur, en la positionnant sur le trou interdigit. appliquer une pression sur le cordon en fermant la pince jusqu’à ce qu’elle pénètre dans le trou.
Ensuite, relâchez l’embryon, scellez la fenêtre de la coquille d’œuf avec du ruban adhésif et retournez les œufs à l’incubateur jusqu’à ce qu’ils aient atteint le stade requis. Pour assurer l’efficacité du dosage, la perle doit être placée de manière cohérente et précise au bon endroit. Dans cette étude, la perle trempée a été placée dans le plus distal du troisième interdigit sous la crête ectodermique apicale.
Les embryons peuvent être colorés avec du bleu océan et du rouge alizarine pour mettre en évidence la formation d’éléments squelettiques et évaluer les effets sur la différenciation cellulaire. Ce test est également bien adapté pour évaluer la mort cellulaire avec un rouge neutre et une régulation génique, en achetant l’hybridation C2. Le principal avantage de cet outil expérimental est de contrôler l’heure et l’emplacement des perles trempées.
La combinaison du positionnement du noyau à un calendrier de développement précis offre d’énormes possibilités pour étudier les processus de différenciation cellulaire.
