يمكن هذا الفحص الطالب من النظر إلى جزيئات محددة في العديد من العمليات التنموية ، مثل تمايز الخلايا وتكوين التشكل عن طريق زرع الخرز في مناطق جنينية متميزة. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي نماذج حيوانية تجريبية ، وزراعة الخلايا ، ونموذج النمط العضوي ، بما في ذلك المواد العضوية. علاوة على ذلك ، إنها أداة تعليمية مفيدة لتدريس البيولوجيا التنموية الأساسية للطلاب.
ستوضح الإجراء ألكسندرا غونزاليس غونزاليس ، وهي طالبة جامعية من المختبر. للبدء ، احتضن بيض دجاج Leghorn الأبيض المخصب عموديا مع الجانب المدبب لأسفل في حاضنة رطبة عند 38 درجة مئوية ورطوبة نسبية 70٪. بمجرد وصولهم إلى المرحلة 28 ، وفقا ل Hamburger و Hamilton ، قم بإزالة البيض من الحاضنة ، واستبدله ب 70٪ من الإيثانول واتركه يجف في الهواء.
ثم تطهير منطقة العمل والمجاهر والأدوات مع 70 ٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، شمعة البيض لتحديد الأوعية الدموية وتحديد موقع الجنين. تخلص من البيض الذي ليس لديه جنين.
باستخدام نهاية ملقط غير مسنن ، افتح نافذة عن طريق النقر على النهاية الحادة للبيضة ، وقم بإزالة قسم قشرة سنتيمتر مربع واحد. ثم ، انقل البيضة إلى حامل كرتوني أو بلاستيكي وضعه تحت المجهر الاستريو. باستخدام ملقط جراحي دقيق ، قم بإزالة أي قطعة صغيرة من قشرة البيض التي يمكن أن تتصل بالجنين وإزالة غشاء الهواء عن طريق ثقبه وسحبه للخارج.
بعد ذلك ، باستخدام ملقط جراحي دقيق ، قم بتمزيق الكيس الأمنيوسي قليلا ، مع الحرص على عدم إتلاف الأوعية الدموية للغشاء Chorioallantoic. مرحلة الأجنة في بوفو لتحديد ما إذا كانت في المرحلة المطلوبة. لإعداد حبة الهيبارين Affi-gel ، قم بقطع قسم بارافيلم مربع الشكل ليتناسب مع طبق بتري 45 ملم.
بعد وضع البارافيلم عبر الجزء السفلي من طبق بتري ، باستخدام نهاية ملقط غير مسنن ، ادفع كل قمة وقم بإصلاحها في أسفل الطبق. بعد ذلك ، باستخدام ماصة أو ملعقة ، قم بنقل الخرز إلى أنبوب طرد مركزي صغير وغسلها مرتين باستخدام PBS من خلال السماح لها بالاستقرار وسحب السوبرنات. ثم ، باستخدام ماصة صغيرة ، انقل 40 إلى 50 خرزة إلى وسط طبق بيتري المغطى بالبارافيلم.
تحت المجهر ، حدد 30 حبة Affi-gel أو الهيبارين التي يبلغ قطرها 100 ميكرومتر. قم بقياس الخرز باستخدام رقم ثالث من جنين مكون من 28 مرحلة كمرجع. يجب أن تكون الخرزة أصغر من الأرقام البينية.
بعد إزالة PBS الزائدة المحيطة بالخرز المحدد بعناية ، انقعها في ميكرولترين إلى خمسة ميكرولتر من محلول العلاج. احتضان الخرز في المحلول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة ، لمنع الخرز من الجفاف ، ماصة بضع قطرات من PBS أو الماء حول الخرز لترطيب الجو المحلي وتغطية الطبق بالبارافيلم لإبطاء التبخر.
صب AG1X2 إعداد حبة. استخدم الملعقة لنقل الخرز إلى أنبوب طرد مركزي صغير وإضافة 50 ميكرولتر من محلول المعالجة بالتركيز النهائي المطلوب. بعد لف الأنابيب بورق لحمايتها من الضوء ، احتضن الخرز لمدة 20 دقيقة عند الاهتزاز البطيء.
بعد الحضانة ، باستخدام ماصة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول المعالجة في وصمة عار مع 0.2٪ من الفينول الأحمر المذاب في الماء لمدة دقيقتين مع إثارة خفيفة في دوامة. بعد التلطيخ ، قم بإزالة الصبغة ، ثم اغسل الخرز مرتين في PBS لإزالة أي صبغة متبقية. بعد ذلك ، باستخدام طرف ماصة صغير ، انقل 40 إلى 50 حبة AG1X2 إلى وسط طبق بتري المغطى بالبارافورم وانقع الخرز في خمسة ميكرولترات من PBS.
ثم تحت المجهر ، حدد حوالي 30 خرزة قطرها 100 ميكرومتر في الحجم. اغمر الخرز المختار في المحلول التجريبي ببضع قطرات من PBS أو الماء حول الخرز لترطيب الغلاف الجوي المحلي. قم بتغطية الطبق بالبارافيلم لإبطاء التبخر.
قبل التلاعب بالأجنة ، رتب مجهرين ستيريو بجانب بعضهما البعض على سطح الطاولة. ثم ، باستخدام ملقط غير مسنن ، قم بإنشاء نافذة في البيض المتبقي. بعد ذلك ، تحت المجهر تمزيق الغشاء الأمنيوسي بالقرب من الطرف الخلفي الأيمن مع ملقط جراحي دقيق.
باستخدام ملقط ناعم ، أمسك الجنين بالغشاء الأمنيوسي لكشف الطرف الخلفي الأيمن. ثم باستخدام إبرة التنغستن الدقيقة ، قم بعمل ثقب متمركز في الانحراف تقريبا من الرقم الثالث من الطرف الخلفي. دون تحرير الجنين والطرف الخلفي المكشوف ، خذ حبة معالجة واحدة من المجهر الآخر باستخدام أحد أطراف الملقط.
يجب أن يكون الملقط مفتوحا لحبة واحدة للالتصاق بطرفها. انقل الخرزة إلى جنين الفرخ بالقرب من الطرف الخلفي ، وضعه فوق الثقب بين الأرقام. اضغط على الخرزة عن طريق إغلاق الملقط حتى تدخل الحفرة.
ثم أطلق سراح الجنين ، وأغلق نافذة قشر البيض بشريط لاصق وأعد البيض إلى الحاضنة حتى يصل إلى المرحلة المطلوبة. لضمان فعالية الفحص ، يجب وضع الخرزة باستمرار وبدقة في الموقع الصحيح. في هذه الدراسة ، تم وضع الخرزة المنقوعة في الجزء السفلي من الأرقام الداخلية الثالثة تحت التلال الخارجية القمية.
يمكن تلطيخ الأجنة باللون الأزرق المحيطي والأحمر الأليزارين لإثبات تكوين عناصر الهيكل العظمي وتقييم التأثيرات على تمايز الخلايا. هذا الفحص مناسب أيضا لتقييم موت الخلايا مع تنظيم محايد للون الأحمر والجيني ، وشراء تهجين C2. الميزة الرئيسية لهذه الأداة التجريبية هي التحكم في وقت وموقع الخرز المنقوع.
يوفر الجمع بين تحديد المواقع الأساسية والتوقيت التنموي الدقيق إمكانيات هائلة لدراسة عمليات تمايز الخلايا.
