Este ensaio permite que o aluno olhe moléculas específicas em muitos processos de desenvolvimento, como diferenciação celular e morfogênese, implantando as contas em regiões distintas de embriões. Este protocolo pode ser aplicado a quaisquer modelos animais experimentais, cultura celular, modelo organotípico, incluindo organoides. Além disso, é uma ferramenta educacional útil para ensinar biologia básica ao desenvolvimento para os alunos.
Demonstrando o procedimento estará Alexandra Gonzales-Gonzales, estudante de graduação do laboratório. Para começar, incubar os ovos de frango leghorn brancos fertilizados verticalmente com o lado pontial ícquico para baixo em uma incubadora umidificada a 38 graus Celsius e 70% de umidade relativa. Assim que chegarem à 28ª etapa, de acordo com Hamburger e Hamilton, retirem os ovos da incubadora, troquem-nos por 70% de etanol e permitam que sequem ao ar.
Em seguida, desinfete a área de trabalho, microscópios e instrumentos com 70% de etanol. Em seguida, velas os ovos para identificar vasos sanguíneos e localizar o embrião. Descarte ovos que não tenham um embrião.
Usando a extremidade de fórceps não dentados, abra uma janela batendo na extremidade contundente de um ovo e remova uma seção de concha de um centímetro quadrado. Em seguida, transfira o ovo para uma caixa ou suporte plástico e coloque-o sob o microscópio estéreo. Usando fórceps cirúrgicos finos, remova qualquer pequeno pedaço de casca de ovo que possa entrar em contato com o embrião e remover a membrana de ar perfurando-a e puxando-a para fora.
Em seguida, usando fórceps cirúrgicos finos, rasgue ligeiramente o saco amniótico, tomando cuidado para não danificar a vasculatura da membrana corioallantóica. Encenou os embriões em ovo para determinar se estão na fase desejada. Para a preparação da conta de heparina de gel Affi, corte uma seção de parafilme em forma quadrada para caber em uma placa de Petri de 45 milímetros.
Depois de colocar o parafilm através do fundo da placa de Petri, usando a extremidade de fórceps não dentados, empurre cada vértice e fixe-o no fundo do prato. Em seguida, usando uma pipeta ou espátula, transfira as contas para um tubo de micro centrífuga e lave-as duas vezes com PBS, permitindo que elas se acomodem e tubos o supernatante. Em seguida, usando uma micro pipeta, transfira de 40 a 50 contas para o centro da placa de Petri coberta de parafilm.
Sob um microscópio, selecione 30 contas de Affi-gel ou heparina com diâmetro de 100 micrômetros. Dimensione as contas usando um terceiro interdigit de um embrião de 28 estágios como referência. A conta deve ser menor que o interdigit.
Depois de remover cuidadosamente o excesso de PBS em torno das contas selecionadas, mergulhe-as em dois a cinco microliters da solução de tratamento. Incubar as contas na solução por 30 minutos em temperatura ambiente. Durante a incubação, para evitar que as contas sequem, pipeta algumas gotas de PBS ou água ao redor das contas para umidificar a atmosfera local e cobrir o prato com parafilme para retardar a evaporação.
Despeje a preparação da conta AG1X2. Use a espátula para transferir as contas para um tubo de micro centrífuga e adicione 50 microliters da solução de tratamento na concentração final desejada. Depois de embrulhar os tubos com papel alumínio para protegê-los da luz, incubar as contas por 20 minutos em tremer lentamente.
Após a incubação, utilizando uma pipeta, remova o máximo possível da solução de tratamento na mancha com 0,2% de fenol vermelho dissolvido em água por dois minutos com leve agitação em um vórtice. Após a coloração, remova o corante e depois lave as contas duas vezes em PBS para remover qualquer corante residual. Em seguida, usando uma ponta de micro pipeta, transfira 40 a 50 contas AG1X2 para o centro da placa de Petri coberta de paraform e mergulhe as contas em cinco microliters de PBS.
Em seguida, sob um microscópio, selecione cerca de 30 contas de 100 micrômetros de diâmetro. Submergir as contas selecionadas na solução experimental com algumas gotas de PBS ou água ao redor das contas para umidificar a atmosfera local. Cubra o prato com parafilm para retardar a evaporação.
Antes de manipular os embriões, organize dois microscópios estéreo um ao lado do outro em um banco. Em seguida, usando fórceps não dentados, crie uma janela nos ovos restantes. Em seguida, sob o microscópio rasgar a membrana amniótica perto do membro traseiro direito com fórceps cirúrgicos finos.
Usando fórceps finos, segure o embrião pela membrana amniótica para expor o membro traseiro direito. Em seguida, usando uma agulha de tungstênio fina, faça um orifício centrado no mais distalmoso do terceiro interdigit do membro traseiro. Sem liberar o embrião e o membro traseiro exposto, pegue uma conta tratada do outro microscópio usando uma das pontas dos fórceps.
Os fórceps devem estar abertos para uma conta para aderir à ponta. Transfira a conta para o embrião de filhote perto do membro traseiro, posicionando-a em cima do buraco interdigit. aplique pressão sobre a conta fechando os fórceps até que entre no buraco.
Em seguida, solte o embrião, sele a janela da casca de ovo com fita adesiva e devolva os ovos à incubadora até que eles cheguem ao estágio necessário. Para garantir a eficácia do ensaio, a conta deve ser colocada de forma consistente e precisa no local correto. Neste estudo, a conta encharcada foi colocada na parte mais distalmosa do terceiro interdigit sob a crista ectodérmica apical.
Os embriões podem ser manchados com azul oceânico e vermelho alizarin para evidenciar a formação de elementos esqueléticos e avaliar os efeitos sobre a diferenciação celular. Este ensaio também é adequado para avaliar a morte celular com regulação vermelha e genética neutra, comprando hibridização C2. A principal vantagem desta ferramenta experimental é controlar a hora e a localização das contas encharcadas.
A combinação do posicionamento central com o timing preciso do desenvolvimento oferece enormes possibilidades de estudar processos de diferenciação celular.
