Sensorische assoziative Lernparadigmen haben viel über die Funktion des Kleinhirns und seine Beziehung zum Rest des Gehirns und sein Verhalten verraten. Anhand der Maus als Modellorganismus stellen wir Laboren weltweit eine Methode mit ausreichenden Details vor, um diese leistungsfähigen Methoden effektiv und kostengünstig umzusetzen. Unser Protokoll wird es Forschern ermöglichen, mehrere kleinhirnabhängige Verhaltensweisen einzurichten.
Die Kernfunktionen unserer Forschungsplattform können leicht an eine bestimmte Forschungsfrage angepasst werden. Schließen Sie zunächst das serielle Schnittstellenkabel der Kamera an die Kamera und den Kameraanschluss an den SBC an. Laden Sie dann das Betriebssystem für den SBC auf den Hostcomputer herunter und erstellen Sie eine Datei namens ssh auf der microSD-Karte.
Werfen Sie die microSD-Karte aus dem Hostcomputer aus. Stecken Sie es in den SBC microSD-Kartensteckplatz und schalten Sie den SBC ein. Um den SBC darauf vorzubereiten, eine kabelgebundene Verbindung zum Host zu akzeptieren, öffnen Sie ein Terminal, geben Sie den Befehl ifconfig" ein und notieren Sie die Ethernet-IP-Adresse des SBC.
Gehen Sie dann zur Registerkarte Schnittstelle der Raspberry Pi-Konfigurationseinstellung und aktivieren Sie die Optionen für Kamera, SSH und VNC. Um die Kabelverbindung herzustellen, schließen Sie ein Ethernet-Kabel an den Ethernet-Port des SBC und eines Host-Computers an und schließen Sie das andere Ende dieser Kabel an einen Ethernet-Switch an. Greifen Sie dann mithilfe eines virtuellen Netzwerk-Computing-Clients, z. B. VNC, über die SBC-IP-Adresse und die Standardauthentifizierung auf den Desktop zu.
Laden Sie als Nächstes die erforderliche Software und die erforderlichen Python-Bibliotheken in den SBC herunter. Um die direkte Steuerung des Mikrocontrollers zu ermöglichen, laden Sie die integrierte Entwicklungsumgebung des Mikrocontrollers oder die IDE-Software herunter. Öffnen Sie dann ein SBC-Terminalfenster, navigieren Sie zum Downloads-Verzeichnis und installieren Sie die IDE.
Nachdem Sie die Mikrocontroller-IDE geöffnet haben, wählen Sie Extras, gefolgt von Bibliotheken verwalten, und installieren Sie die Encoder-Bibliothek von Paul Stoffregen. Stecken Sie abschließend einen USB-Stick in einen USB-Anschluss am SBC und geben Sie die Befehle zum Mounten des externen USB-Speichergeräts ein. Nachdem Sie den SBC an den Programmierport des Mikrocontrollers angeschlossen haben, öffnen Sie die Download-Skizze mit der Mikrocontroller-IDE und laden Sie sie auf den Mikrocontroller hoch.
Laden Sie als Nächstes die entsprechende Version der Arduino-IDE herunter und installieren Sie sie auf dem Host-Computer. Laden Sie dann die DTSC_US herunter. ino sketch auf dem Hostcomputer.
Schließen Sie das USB-A-auf-USB-B-Kabel an den Hostcomputer und den Mikrocontroller an. Öffnen Sie die Skizze, und laden Sie sie auf den Mikrocontroller hoch. Befestigen Sie Drähte an der Steckplatine des Mikrocontrollers, LEDs, Drehgeber, Schrittmotor mit Treiber und Magnetventil mit Treiber.
Verdrahten Sie dann einen Kanal einer Stromversorgung mit den Plus-V- und GND-Pins des Schrittmotortreibers. Stellen Sie nach dem Einschalten der Stromversorgung die angeschlossene Kanalspannung auf 25 Volt ein. Als nächstes verdrahten Sie die positive Leitung eines Netzteils mit dem Magnetventiltreiber-Hold-Voltage-Pin und die andere positive Leitung mit dem Spike-Voltage-Pin.
Stellen Sie nach dem Einschalten der Stromversorgung den Kanal, der mit der Spike-Spannung verbunden ist, auf 12 Volt und den Kanal, der mit der Haltespannung verbunden ist, auf 2,5 Volt ein. Schließen Sie dann eine auf einen Druck von 20 Pfund pro Quadratzoll geregelte Luftquelle an das Magnetventil an. Als nächstes, um das laufende Rad zu machen, schneiden Sie ein Drei-Zoll-Rad von einer Schaumstoffrolle und bohren Sie ein Viertel-Zoll-Loch in die genaue Radmitte.
Setzen Sie dann eine Viertelzollwelle in das Rad ein und befestigen Sie sie mit Klemmnaben. Befestigen Sie den Drehgeber an einem 4,5-Zoll-Aluminiumkanal. Stabilisieren Sie dann den Aluminiumkanal auf dem Aluminium-Panierbrett.
Nachdem Sie das Rad am Drehgeber befestigt haben, stabilisieren Sie die freie Seite der Radwelle mit einem Lager, das in eine rechtwinklige Endklemme eingesetzt ist, die auf einem an einer Steckplatine montierten optischen Pfosten installiert ist. Als nächstes positionieren Sie die Kopfstützen mit optischen Pfosten und rechtwinkligen Pfostenklemmen. Positionieren Sie dann die bedingte Reiz-LED und den Magnetventilauslass für den bedingungslosen DEC-Stimulus um das montierte Rad.
Als nächstes montieren Sie den Schrittmotor, der für den bedingungslosen DTSC-Stimulus und die Pi-Kamera verwendet wird, an einem optischen Pfosten. Platzieren Sie das Infrarotlicht-Array auf der gleichen Seite wie die Pi-Kamera, etwas über und direkt mit der Perspektive, wo das Gesicht des Tieres positioniert wird. Machen Sie einen taktilen Reiz für eine verzögerte taktile Schreckenkonditionierung, indem Sie Schaum an den Rand eines Stücks Acryl kleben.
Mit einer Klemmnabe an einer Viertelzollwelle befestigen und dann den taktilen Reiz an der Schrittmotorwelle befestigen. Um eine Kopfplatte zu implantieren, betäuben Sie die Maus und machen Sie dann einen Schnitt mit einem Skalpell entlang der Mittellinie der Kopfhaut, vom hinteren Rand der Augen bis zum Schädel. Breiten Sie den Einschnitt auf und klemmen Sie beide Seiten mit Hämostaten ein, um ihn offen zu halten.
Befestigen Sie die Kopfplatte mit Cyanacrylatkleber am Schädel. Tragen Sie dann eine Mischung aus Zahnzementpulver, Lösungsmittel und Katalysator auf alle Bereiche des exponierten Knochens auf. Nähen Sie die Haut geschlossen, hinter und vor der Kopfplatte.
Injizieren Sie dann postoperative Analgesie, während sich die Maus mindestens fünf Tage lang erholen kann. Um die Mäuse auf Verhaltenssitzungen vorzubereiten, lassen Sie sie sich an die Plattform gewöhnen, indem Sie sie in der Kopfstütze montieren. Stellen Sie vor der Sitzung sicher, dass der Magnetventilauslass auf dem Zielauge zentriert ist, weniger als einen Zentimeter entfernt positioniert ist und der taktile Reiz auf der Nase der Maus zentriert ist, die etwa 1,5 Zentimeter entfernt ist.
Starten Sie für die DTSC-Sitzungsvorbereitung die GUI von einem SBC-Terminal aus. Führen Sie eine Testsitzung mit drei Versuchen durch, und stellen Sie sicher, dass die protokollierten Daten, die auf das Terminal gedruckt werden, eine Ablenkung von mehr als 20, aber weniger als 100 Schritten aufweisen. Um eine Sitzung auszuführen, montieren Sie eine Maus an der Kopfstütze und starten Sie die GUI über das SBC-Terminal.
Um Kameraaufnahmen zu speichern, klicken Sie auf die Schaltfläche Stream, bevor Sie die Sitzung starten. Geben Sie identifizierende Informationen für das Tier in das Feld Tier-ID ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Festlegen. Geben Sie dann die gewünschten Experimentparameter ein und klicken Sie auf die Schaltfläche "Auf Arduino hochladen".
Klicken Sie abschließend auf Sitzung starten, um die Sitzung zu beginnen. DEC-Trainingsergebnisse aus einer Aufzeichnungssitzung mit akzeptabler Beleuchtung werden hier gezeigt. Die akzeptablen Beleuchtungsbedingungen führten zu einem guten Kontrast zwischen Auge und periokularem Fell.
Die Leistung einer einzelnen Maus, die für acht Sitzungen trainiert wurde, zeigte Verhaltensspuren, ohne konditionierte Reaktion bei der untrainierten Maus, und robuste konditionierte Reaktionen, sobald die Maus trainiert wurde. Ein Beispiel-Testvideo zeigt, wie eine trainierte Maus erfolgreich ihr Auge als Reaktion auf den bedingten LED-Reiz schließt, während die untrainierte Maus erst beim bedingungslosen Reiz blinzelt. Die konditionierte Reaktion nimmt durch Verhaltenssitzungen, die über Tage hinweg durchgeführt werden, an Größe und Häufigkeit zu.
Suboptimale Lichtverhältnisse schränken die Qualität der erfassten Daten stark ein. Wenn der Kontrast zwischen dem Auge und dem umgebenden Fell gering ist, können geringfügige Änderungen im Bild die aufgezeichnete Form der unkonditionierten Reaktion über eine einzelne Sitzung erheblich verändern und das Signal-Rausch-Verhältnis zur Erkennung der Augenlidposition verringern. DTSC-Trainingsergebnisse für eine Maus, die für fünf Sitzungen trainiert wurde, werden hier vorgestellt.
Ein Beispiel-Testvideo zeigt eine trainierte Maus, die das Rad erfolgreich als Reaktion auf den bedingten LED-Reiz unterstützt, während eine untrainierte Maus das Rad nicht bewegt, bis der taktile bedingungslose Reiz angewendet wird. Die Frequenz und Amplitude der konditionierten Reaktion nehmen mit zunehmendem Training zu. In einer Kohorte von Tieren, die mit einem bedingungslosen Reiz trainiert wurden, der unbedingte Reaktionen mit niedriger Amplitude erzeugte, lernte kein Tier nach vier Tagen Training, konsequent konditionierte Reaktionen zu erzeugen.
Für ein erfolgreiches Verhalten ist der Komfort des Tieres beim Laufen auf dem Rigg von entscheidender Bedeutung. Es ist wichtig sicherzustellen, dass sich das Rad frei und gleichmäßig dreht, bevor sich Tiere an das Rigg gewöhnen. Mit dieser flexiblen Plattform haben wir die Aktivität von Purkinje-Neuronen, den Ausgangszellen des Kleinhirns, während des Lernens bei kopffixierten Tieren erfolgreich abgebildet und gestört.
