Wenn eine bestimmte Proteinfunktion durch Genmanipulation verändert wird, wird die Koordination von reizendem Versagen und motorischer Laufbeeinträchtigung als notwendige Voraussetzung für einen kausalen Zusammenhang zwischen LTD und motorischem Lernen angesehen. Hier zeigen wir die Verwendung mehrerer Protokolle zur Beurteilung von LTD, die über Kompensationsmechanismen bei genmanipulierten Tieren induziert werden können. Vor der Ernte des Gehirns, kühlen und sauerstoffig zwei 50 Milliliter Becher von ACSF auf Eis.
Wenn die Lösungstemperatur unter vier Grad Celsius liegt, fügen Sie 50 Mikroliter eines Millimolaren Tetrodotoxins zu einem der eiskalten Becher hinzu. Um das Gehirn zu ernten, halten Sie den Kopf und verwenden Sie ophthalmologische Schere, um die oberflächliche Haut entlang der Mittellinie zu schneiden. Ziehen Sie die Haut manuell zurück, um die Schädeloberfläche weit freizulegen, und schneiden Sie mit der Schere den Schädel horizontal vom großen spinokerebellären Loch bis knapp über den Augen und Ohren entlang, bevor Sie den Schädel entlang einer Linie über beiden Augen schneiden.
Verwenden Sie ein Skalpell, um das Gehirn in der Mitte des Großhirns zu schneiden und den kaudalen Teil des Gehirns, einschließlich des Kleinhirns, vom Schädel zu isolieren. Tauchen Sie die Probe in den eiskalten Becher von ACSF ein und stellen Sie die Blasenschläuche so ein, dass sie den Hirnblock im Becher nicht rühren. Nach mindestens sieben Minuten, verwenden Sie einen Spachtel, um den Gehirnblock zu nehmen und verwenden Sie ein Stück Filterpapier, um überschüssige ACSF zu absorbieren.
Montieren Sie die Gewebe-Ventralseite auf ein zwei mal zwei Zentimeter großes Stück Agar mit einem geeigneten medizinischen Klebstoff. Verwenden Sie eine Klinge, um die rechte Hemisphäre des Hirngewebes so parallel zur dendritischen Ebene der Purkinje-Zellen wie möglich auszuschneiden. Schneiden und entfernen Sie die andere Seite der Hemisphäre und schneiden Sie das Gehirn zwischen dem überlegenen und unteren Colliculi.
Schneiden Sie das Rückenmark ab und kleben Sie die rechte Seite des getrimmten Kleinhirns mit dem Agarblock auf das vorgekühlte Probentablett. Dann kippen Sie das Probentablett, gießen Sie ACSF auf die Probe, um das Gewebe zu fixieren und überschüssigen Klebstoff wegzuwaschen. Um die Hirnprobe in Scheiben zu schneiden, orientieren Sie die Probe so, dass die dorsale Seite des Kleinhirns an der Vorderseite ist, und gießen Sie genug von dem eiskalten Schneiden ACSF mit Tetrodotoxin ergänzt, um das Kleinhirn vollständig einzutauchen.
Legen Sie ein Gasrohr in die Schneidlösung und initiieren Sie das Blasen mit einem Sauerstoff-Kohlendioxid-Gasgemisch. Mit feiner Pinzette und Lupen entfernen Sie die Arachnoide Mater und verbrauchen den Kleinhirn-Pedunkel. Nach dem Entfernen des Hirnstamms und des Agarblocks drehen Sie die Schale um 180 Grad, so dass die dorsale Oberfläche des Kleinhirns der Rasierklinge des Vibratom gegenübersteht, und passen Sie die erste Schnittposition an.
Stellen Sie die Vibratome-Amplitude auf 5,5 und die Frequenz auf 85 Hertz, die Geschwindigkeit auf drei bis vier und die Scheibendicke auf 300 Mikrometer. Wenn die Kleinhirnscheiben erhalten werden, verwenden Sie ein Nylonnetz, um die Abschnitte in einem 26 Grad Celsius Wasserbad in einen Acryl-Inkubator zu übertragen und die Proben mindestens eine Stunde lang vollständig in frisches, mit Sauerstoff versorgtes ACSF einzutauchen. Für die Meldung von ganzzelligen Pflasterklemmen ein mikromolares Pikrotoxin in ACSF durch Ultasonication drei Minuten lang auflösen, bevor eine 30 Grad Celsius Aufnahmekammer mit der Toxinlösung bei einer Durchflussrate von zwei Millilitern pro Minute durchdringend wird.
Nach einigen Minuten eine Kleinhirnscheibe in die Aufnahmekammer geben und das Gewebe mit platinen- und Nylonfäden fixieren. Dann eine anregende Elektrode mit frischem ACSF füllen. Um die parallelen Fasern zu stimulieren, legen Sie die stimulierende Elektrode auf die Oberfläche der Molekülschicht etwa 50 Mikrometer aus der Purkinje-Zellschicht.
Zur Stimulation der Kletterfasern legen Sie die stimulierende Elektrode an den Boden der Purkinje-Zellschicht und füllen Sie mit einem Mikrolader eine Aufnahmeelektrode mit acht Mikrolitern 0,45 Mikrometer gefilterter Kalium- oder Cäsium-basierter Internienlösung. Tragen Sie einen schwachen positiven Druck auf die Aufnahmeelektrode auf, bevor Sie die Elektrode in den ACSF eintauchen. Der Elektrodenwiderstand sollte zwei bis vier Megaohm betragen und das flüssige Anschlusspotential korrigiert werden.
Nähern Sie sich dem gesunden hellen Zellkörper einer Purkinje-Zelle mit der Aufnahmeelektrode und drücken Sie die Oberfläche der Purkinje-Zelle leicht. Dann aufhören, den positiven Druck anzuwenden und unterdruck zu machen, bis eine Gigaohm-Dichtung gebildet wird. Verwenden Sie dann untere Druck, um eine ganze Zellkonfiguration zu etablieren, wobei das Membranpotenzial bei minus 70 Millivolt erhalten bleibt und ein Minus von zwei Millivolt-100-Millisekunden-Impulsen bei 0,1 Hertz angewendet wird, kontinuierlich den Eingangswiderstand, den Reihenwiderstand und die Eingangskapazität überwachen.
Für eine langfristige Depressionsinduktion stimulieren Sie die molekulare Schicht mit einem 0,1 Millisekunden-Impuls und wenden Sie einen Doppelpulsreiz an, um die parallelfaserexzitatorischen postsynaptischen Ströme zu identifizieren. Eine gepaarte Pulserleichterung und eine allmähliche Erhöhung der Amplitude im Verhältnis zur Erhöhung der Stimulationsintensität sollten beobachtet werden. Um das Testverhalten aufzuzeichnen, wenden Sie einen einzelnen 0,1 Hertz-Impuls an und passen Sie die Intensität des Stimulus so an, dass die evozierte Amplitude etwa 200 Picoamps beträgt.
Stimulieren Sie die Kletterfasern am Boden der Purkinje-Zellschicht und um die parallelfasererexitatorischen postsynaptischen Ströme zu identifizieren, die durch die Aktivierung der Kletterfaser ausgelöst werden, wenden Sie einen doppelten Pulsreiz an. Eine gepaarte Pulsdepression sollte in einer Ganzer oder gar keiner Weise in Korrelation mit der Erhöhung der Stimulationsintensität beobachtet werden. In diesem repräsentativen Experiment wurde eine Konjunktion einer parallelen Faserstimulation und einer Kletterfaserstimulation unter aktuellen Klemmbedingungen für die Scheibenvorbereitung verwendet.
Die Form der komplexen Spitze, die durch die Konjunktivstimulation ausgelöst wurde, ähnelte der, die allein durch die Kletterfaserstimulation mit dem ersten steilen Spikelet, gefolgt von zwei bis drei Spikelets, ausgelöst wurde. Eine ähnlich geformte komplexe Spitze wurde beobachtet, als 50 Millisekunden später eine parallele Faserstimulation durch eine konjunktive Zweite parallele und kletterfaserreinstimulation folgte. Bei diesem Test unter Spannungsklemmenbedingungen mit einer Cäsium-basierten internen Lösung wurde 50 Millisekunden später eine parallele Faserstimulation durch eine gleichzeitige Anwendung einer zweiten parallelen Faserstimulation und somatischen Depolarisation verfolgt.
Bei der somatomatischen Depolarisation von minus 70 auf null Millivolt wurde ein Innenstrom ausgelöst und der Schwanzstrom wurde auch nach der Repolarisation heraufbeschworen. Schließlich wurden fünf parallele Faserreize bei 100 Hertz gleichzeitig mit der somatischen Depolarisation unter Spannungsklemmenbedingungen gegeben. Auch hier wurde während der Depolarisation eine sich wiederholende Erzeugung von Innerenströmungen ausgelöst und der Schwanzstrom wurde nach der Repolarisation induziert.
Um die Beziehung zwischen Kleinhirn-LTD und motorischem Lernen bei genmanipulierten Tieren zu beurteilen, sollten mehrere Protokolle verwendet werden, um LTD unter gemütlichen physiologischen Bedingungen zu induzieren. Wenn Kleinhirn-LTD bei genmanipulierten Tieren nach dem motorischen Lernen visualisiert wird, kann die kausale Beziehung zwischen ihnen direkter untersucht werden.
