Wir möchten L. Evans, B. Granger, D. Rissling, Z. Sim, A. Goodwin, K. Hayhurst und D. Kuch für die Unterstützung im Bereich danken. K. Galbreath freundlicherweise zur Verfügung gestellt pika Leber Proben aus dem Bella Coola Tal. Vielen Dank an A. Gonçalves da Silva und K. Larsen für interessante Diskussionen, die das Design dieser nichtinvasiven genetischen Probenahmeverfahren beigetragen. Diese Arbeit wurde vom kanadischen Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery, und UBC Okanagan Individual Forschungsstipendien MAR finanziert. A Swiss National Science Foundation Doctoral Fellowship PBSKP3_128523 unterstützt PH. Diese Studie wurde im Anschluss an die Tierpflege-Protokoll von der University of British Columbia (: A07-0126-Zertifikat-Nummer) durchgeführt.

1. Haare Snare Vor dem Einrichten einer Schlinge, hat eine ideale Lage innerhalb des pika Lebensraum oder Geröllhalde bestimmt werden. Dazu gehören Heuhaufen, die Vegetation Caches, die Tiere zu sammeln im Spätsommer sowie frische scats bei Latrine Websites zu finden sind. Streifen aus Klebeband (10-50cm Länge) sind bis zu einer 360 °-klebrige Oberfläche bieten gerollt und sind in einem Web-Manier zum Umschlag der Eingang zum pika ist Heu Stapel (Abb. 1) oder Latrine Seite angeordnet. Abhängig von der Konfiguration der Felsen, kann ein Stück Angelschnur verwendet werden, um die Struktur des Haares Schlinge zu unterstützen, aber das ist oft nicht nötig, wenn Eingänge recht klein (&lt;30cm im Durchmesser) sind, eine vollständige Beschreibung des Einsatzes von Angelschnur in Henry und Russello (2010) 3 gefunden werden. Haare Fallen sind so oft wie möglich geprüft und Haarproben abgeschieden auf dem Band (Abb. 2) werden dann gesammelt und beschriftet. Sobald transportiert zurück ins Labor werden die Haare aus dem Klebeband mit einer sterilen Pinzette entnommen und in Kryoröhrchen und bei -20 ° C bis auf weiteres Manipulation. Haarproben gemeinsam auf ein Haar Snare Cluster werden als ein einzelnes Individuum gehören, während die Proben Cluster unabhängig davon ausgegangen werden, um verschiedene Individuen angehören. Im letzteren Fall ist das Haar dann in verschiedene Röhrchen. Diese Annahmen können später mittels DNA-Fingerprints und Berechnungen der Wahrscheinlichkeit von Identität auf Mikrosatelliten genotypischen Daten getestet werden. 2. DNA-Extraktion Da pika Haar ist sehr dünn und enthält eine winzige Wurzel Glühbirne, haben wir bereits gezeigt, dass ein Minimum von 25 Haare notwendig sind, um ausreichende Mengen an DNA für eine gute Qualität nachgeschalteten PCR-Amplifikation 3 zu erhalten. Wir verwendeten die DNA IQ-System (Promega, Madison, WI, USA) und eine leicht modifizierte Version des Herstellers für DNA-Isolierung aus Haarproben. Erstens ist die Haarprobe in einem Mikro-Zentrifuge geschleudert, um Haarausfall zu vermeiden, während dem Öffnen der Tube. Dann wird die Inkubation Lösung wird durch Mischen von 80 ul der Inkubationslösung mit 10 &amp;mgr; l von DTT (1M) und 10 &amp;mgr; l von Proteinase K (18ng/ml) in einer Endkonzentration von 0,1 M DTT und 1.8ng/ml von Proteinase K. Incubation Ergebnis vorbereitet Lösung (100 ul) wird auf die Probe zugegeben und bei 56 ° C für 1 Stunde. In der Zwischenzeit ist die Lyse-Lösung durch Zugabe von 1 ul der DTT (1M) für jeweils 100 ul Lysepuffer, was zu einer endgültigen DTT Konzentration von 0,01 M vorbereitet. Vorbereitet Lyse-Lösung (200 ul) wird dann auf die Probe gegeben, zusammen mit 7 ul der DNA IQ Harz, gevortext für 3 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit und bei Raumtemperatur inkubiert für 5 Minuten. Die Probe wird dann für 2 Sekunden gevortext und in die magnetische Halterung, wo die Trennung von magnetischen Kügelchen aus der Lösung auftritt. Die verbleibende Lösung wird dann abgesaugt und verworfen, darauf achten, daß das Pellet aus magnetischen Harz zu stören. Die Probe wird dann mit 100 ul der vorbereiteten Lyse-Lösung gevortext und wieder in die magnetische Halterung, wo die Trennung erfolgt wieder behandelt. Der Lysepuffer wird abgesaugt und verworfen, und dieser Schritt wird dreimal wiederholt mit einem Waschpuffer (100 ul). Die Probe wird anschließend links in die magnetische Halterung für 15 Minuten trocknen lassen. Nach dem Trocknen ist 100 ul Elutionspuffer auf die Probe zugegeben und bei 65 ° C für 5 Minuten. Die Probe wird verwirbelt und in die magnetische Halterung. Die Lösung enthält jetzt die eluierte DNA wird dann in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführt und bei -20 ° C bis auf weiteres Manipulationen. DNA aus der Leber Proben wurde ebenfalls extrahiert mit der DNA IQ-System und als positive Kontrolle für die PCR-Amplifikationen. 3. PCR-Amplifikation Die DNA aus unserer nichtinvasiven Haar Snare und die Leber erhaltenen Proben wurden dann verwendet, um eine Reihe von häufig verwendeten molekularen Marker (Mikrosatelliten, AFLP, mitochondrialen Cytochrom B und ZFX / ZFY Geschlechtsbestimmung Marker) zu verstärken. PCRs wurden mit einem Veriti Thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) in einem 25 ul Volumen enthält: 10 bis 20 ng DNA, 0,5 uM von jedem Primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 200 uM dNTPs, 10 μ Rinderserumalbumin (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) und 0,5 U AmpliTaq Gold DNA-Polymerase (Applied Biosystems). Radfahren Parameter für den Mikrosatelliten-Loci wurden optimiert mit einem Touchdown PCR-Programm (10 min bei 95 ° C, 35 Zyklen bei 95 ° C für 30 s, 30 s Annealing und 45 s bei 72 ° C, durch einen letzten Schritt bei 72 ° C für 10 min). Die Annealingtemperatur um 1 verringert ° C pro Zyklus von 60 bis 55 ° C bis zum Erreichen des sechsten Zyklus, an welcher Stelle der 29 verbleibenden Zyklen bei 55 ° C. Radfahren Parameter für die mitochondriale Fragmente wurden wie oben beschrieben, aber bestand aus 35 Zyklen mit einer Glüh-Temperatur von 50 ° C. Amplified Fragment Length Polymorphism wurde nach dem Protokoll für Wirbeltier-Genomen von Bonin 4 beschrieben durchgeführt. Schließlich wurde molekularen Geschlechtsbestimmung durchgeführt unter Verwendung des PCR-RFLP von ZFX / ZFY loci mit HinfI Restriktionsenzymverdau 5. Die PCR-Produkte aus der Mikrosatelliten, AFLPs und Cytochrom B-Sequenzen wurden auf einem ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems) laufen, während verdaut ZFX / ZFX Fragmente neben einem 100 bp Leiter (New England Biolabs) auf einem 3% Agarosegel mit ausgeführt wurden 2,5% SYBR Sicherer DNA-Gel-Färbung (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und visualisiert mit einer RED persönlichen Gel Imaging System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA). Mikrosatelliten und AFLPs wurden mittels GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) und die mitochondriale DNA Chromatogramm wurde unter Verwendung Sequencher v4.7 (Gene Codes Corporation, Ann Harbour, MI, USA). 4. Repräsentative Ergebnisse Die DNA aus Haarproben unter Verwendung unserer nichtinvasiven Snare extrahiert wurden verwendet, um PCR zu amplifizieren verschiedenen Typen von molekularen Markern. Als Grundlage für den Vergleich, extrahierten DNA mit Leberproben neben unseren Haarproben wurde verstärkt. Nuclear Mikrosatelliten-Loci wurden erfolgreich sowohl für Haare und Leber-Proben (Abb. 3) verstärkt. Obwohl die Intensität des Signals war größer, wenn Sie die Leberproben, tat dies keinen negativen Einfluss auf Genotyp Scoring (Abb. 3). Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn AFLPs (Abb. 4), mitochondriale DNA-Sequenzen (Abb. 5), und der ZFX / ZFY molekularen Geschlechtsbestimmung Marker (Abb. 6). <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Ein Beispiel für eine nicht-invasive Haar Snare eingerichtet in einem Heu Stapel. Strips von aufgerollt klar Klebeband sind in einem Web-artig an den Eingang, um das Heu Stapel legen angeordnet. Ein Stück Angelschnur ist hier, um zusätzliche Unterstützung für die Haare Snare bereitzustellen. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Eine erfolgreiche Haar Schlinge mit einer großen Anzahl von Haaren klebte an das Klebeband. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Ein Vertreter nuklearen Mikrosatelliten-Chromatogramm (Ocp6) 8 als in GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) angezeigt. Die obere Chromatogramm wurde durch Amplifikation von DNA aus Lebergewebe gewonnen und ist heterozygot (354/358) an diesem Locus. Die untere Chromatogramm repräsentiert eine andere Person ausstellen einem heterozygoten Genotyp (358/362) auf die DNA aus Haaren extrahiert wurden. Während das Signal des Chromatogramms aus der Haarprobe hat eine geringere Intensität als die Leber Probe wird Genotyp Scoring nicht durch diesen Unterschied im Signal betroffen. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Ein Vertreter AFLP Chromatogramm (E31T32) als in GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) angezeigt. Die obere Chromatogramm durch Amplifikation von DNA aus Lebergewebe gewonnen wurde, stellt die untere Chromatogramm der DNA aus Haaren extrahiert. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig5.jpg" alt="Abbildung 5"/> Abbildung 5. Ein Vertreter mitochondriale DNA-Sequenz-Chromatogramm (Cytochrom B) wie in Sequencher v4.7 (Gene Codes Corporation) angezeigt. Die obere Chromatogramm durch Amplifikation von DNA aus Lebergewebe gewonnen wurde, stellt die untere Chromatogramm der DNA aus Haaren extrahiert. <img src="/files/ftp_upload/2791/2791fig6.jpg" alt="Abbildung 6"/> Abbildung 6. Ein Vertreter molekularen Geschlechtsbestimmung Marker (ZFX / ZFY) sowohl für Leber-und Haarproben verstärkt. Dieser Ansatz beruht auf der Beobachtung, dass die Y Chromosom ein HinfI Restriktionsschnittstelle in dieser Region, dem X-Chromosom fehlt besitzt. So produzieren Weibchen zwei Co-Migration Fragmente von 432 bp, während männliche Fragmente von 432 bp, 261 bp und 171 bp produzieren.

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	<li>Kendall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demography+and+Genetic+Structure+of+a+Recovering+Grizzly+Bear+Population.">Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population.</a> J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).</li><li>Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+genetic+evaluation+of+population+size,+natal+philopatry,+and+roosting+behavior+of+non-breeding+eastern+imperial+eagles+(Aquila+heliaca)+in+central+Asia.">A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia.</a> Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).</li><li>Henry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+population+structure+and+ex+situ+representation+of+the+endangered+Amur+tiger.">In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger.</a> Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).</li><li>Henry, P., Russello, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obtaining+high+quality+DNA+from+elusive+small+mammals+using+low-tech+hair+snares.">Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares.</a> Eur J Wildlife Res. , (2010).</li><li>Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+amplified+fragment+length+polymorphism+(AFLP)+markers+in+surveys+of+vertebrate+diversity.+Method+Enzymol+395.">Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395.</a> , 145-145 (2005).</li><li>Fontanesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexing+European+rabbits+(Oryctolagus+cuniculus),+European+brown+hares+(Lepus+europaeus)+and+mountain+hares+(Lepus+timidus)+with+ZFX+and+ZFY+loci.">Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci.</a> Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).</li><li>Piggott, M. P., Taylor, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+collection+of+animal+DNA+and+its+applications+in+conservation+management+and+understanding+the+population+biology+of+rare+and+cryptic+species.">Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species.</a> Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).</li><li>Banks, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demographic+monitoring+of+an+entire+species+(the+northern+hairy-nosed+wombat,+Lasiorhinus+krefftii)+by+genetic+analysis+of+non-invasively+collected+material.">Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material.</a> Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).</li><li>Litvaitis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+range-wide+survey+to+determine+the+current+distribution+of+New+England+cottontails.">A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails.</a> Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).</li><li>Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+nine+polymorphic+microsatellite+loci+in+the+North+American+pika,+Ochotona+princeps.">Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps.</a> Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).</li></ol>

Nichtinvasive genetische Probenahme hat sich zu einer attraktiven Alternative zu herkömmlichen Live Fangmethoden aus mehreren Gründen. Erstens, indem unauffällig Sammeln biologischem Material (zB Kot, Haare, Federn, Speichel und Schleim) aus Wildpopulationen, können die Forscher diese Arten ohne störende Studie, Handhabung, oder gar sie zu beobachten, damit die Risiken für Tiere und Forscher. Zweitens ermöglicht nicht-invasive genetische Probenahme Biologen die Bevölkerung auf schwer fassbare und seltene Arten, eine Aufgabe, die sich als schwierig erweisen mit mehr traditionelle Live-trapping Ansätze 6 können zu studieren. Und drittens kann NGS potenziell erhöhen Stichprobengrößen durch Reduzierung Störung von Tieren, die Probenahme Anstrengungen und Kosten und hilft so zu minimieren Verzerrungen bei der Schätzung der Bevölkerung Parameter 7. Dieser letzte Punkt kann entscheidend sein im Umgang mit bedrohten Arten, da verzerrten Schätzungen der Bevölkerung Parameter in einer unangemessenen Verwaltung führen kann. Im vorliegenden Video-Artikel beschreiben wir eine einfache, neue, kostengünstige und nicht-invasive Methode, um schwer fassbare kleine Säugetiere Probe, mit der American Pika als Beispiel. Wir zeigen, dass DNA aus Haaren extrahiert führt ähnlich wie DNA aus der Leber Proben im Hinblick auf Mikrosatelliten, AFLP, Mitochondrien und Geschlechtsbestimmung Marker extrahiert, so dass diese nicht-invasive Probenahme eine attraktive Alternative zum Einfangen oder tödliche Probenahme leben. Insgesamt erwarten wir, dass diese Methode wird in der Datensammlung Stadium der populationsgenetische und Verhaltensstudien von seltenen oder schwer zu kleine Säugetierarten nützlich, bei gleichzeitiger Minimierung der Auswirkungen auf die Organismen unter-Studie.

Haare Snare: <ul><li> Rolls klarer Klebeband (3M, St. Paul, MN, USA) </li><li> Angelschnur (10lb) </li><li> Kryo-Röhrchen (2 ml) </li><li> Sterile Pinzette </li><li> Flüssiger Stickstoff Dewar (optional) </li></ul> DNA-Extraktion: <ul><li> DNA IQ System (Kat. Nr. DC6701, Promega) mit dem Gewebe und Haare Extraktion Kit (Kat. Nr. DC6740, Promega). </li><li> MagneSphere Technologie Magnetic Separation Stand (Kat. Nr. Z5342, Promega) </li><li> Micro-Zentrifuge </li><li> Hybridisierungsofen oder im Wasserbad </li><li> 1,5 ml Eppendorf Tubes </li></ul>

a noninvasive hair sampling technique to obtain high quality dna from elusive small mammals

Nichtinvasive genetische Probenahme Ansätze werden immer wichtiger, um Wildbestände zu studieren. Eine Reihe von Studien haben berichtet, unter Verwendung nichtinvasiver Stichprobenverfahren zur Populationsgenetik und Demographie der Wildpopulationen 1 Untersuchen. Dieser Ansatz hat sich als besonders nützlich, wenn es sich um seltene oder schwer Spezies 2. Während eine Reihe dieser Methoden auf Probe Haare, Kot und andere biologische Material aus Fleischfresser und mittelgroße Säugetiere entwickelt haben, haben sie blieben weitgehend ungetestet in schwer fassbaren kleinen Säugetieren. In diesem Video präsentieren wir eine neue, kostengünstige und nicht-invasive Haar Schlinge um einen schwer fassbaren kleines Säugetier, das amerikanische pika (Ochotona princeps) ausgerichtet. Wir beschreiben die allgemeinen Aufbau des Haares Schlinge, die aus Streifen von Klebeband in einem Web-artig angeordnet und platziert neben Reiserouten in die Pfeifhasen &quot;Lebensraum besteht. Wir illustrieren die Effizienz der Schlinge zu sammeln eine große Menge an Haaren, die dann gesammelt werden können und ins Labor gebracht. Wir haben dann demonstrieren die Verwendung der DNA-IQ-System (Promega), um DNA zu isolieren und zeigen die Nützlichkeit dieses Verfahrens auf häufig verwendete molekulare Marker einschließlich der nuklearen Mikrosatelliten, Amplified Fragment Length-Polymorphismen (AFLPs), mitochondriale Sequenzen (800bp) sowie Verstärkung eines molekulare Geschlechtsbestimmung Marker. Insgesamt zeigen wir den Nutzen dieser neuartigen nicht-invasiven Haar Snare wie ein Verfahren zur Probenentnahme für die Tierwelt Bevölkerung Biologen. Wir gehen davon aus, dass dieser Ansatz wird für eine Vielzahl von kleinen Säugetieren, Öffnung Bereichen Untersuchung innerhalb natürlicher Populationen, bei gleichzeitiger Minimierung der Auswirkungen auf die Studie Organismen.

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A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Wir präsentieren ein nicht-invasives Vorgehen bei der Probennahme, um effizient zu sammeln Haarproben von schwer fassbaren kleinen Säugetieren, wie für den amerikanischen pika gezeigt. Wir demonstrieren den Nutzen dieser Methode durch Extraktion von DNA aus Proben Haar und verstärkt verschiedene Arten von molekularen Markern häufig in Studien für Wildtierkunde und Ökologie und Naturschutz eingesetzt.

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.6K Aufrufe.  University of British Columbia, Okanagan Campus. Wir präsentieren ein nicht-invasives Vorgehen bei der Probennahme, um effizient zu sammeln Haarproben von schwer fassbaren kleinen Säugetieren, wie für den amerikanischen pika gezeigt. Wir demonstrieren den Nutzen dieser Methode durch Extraktion von DNA aus Proben Haar und verstärkt verschiedene Arten von molekularen Markern häufig in Studien für Wildtierkunde und Ökologie und Naturschutz eingesetzt.

Serie: A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

Beziehen High Quality-RNA aus Einzel-Zellpopulationen in menschlichen Postmortem Gehirngewebe

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Forschung

Biologie

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

Nichtinvasive In Vivo Small Animal MRI und MRS: Basic Experimentelle Verfahren

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridisierung und Scannen

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht von mikrobiellen Matten

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Ein Handbuch Kleine Molecule Bildschirm Nähern Hochdurch Mit Zebrafischembryonen

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Ein Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für die qualitative und quantitative Bewertung der bakteriellen Gemeinschaften aus Zucht Proben

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

A New Technique for Quantitative Analysis of Hair Loss in Mice Using Grayscale Analysis

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and alopecia areata. Alopecia can also occur as a side effect of chemotherapy in cancer patients. In this study, our goal was to develop a consistent and reliable method to quantify hair loss in mice, which will allow investigators to accurately assess and compare new therapeutic approaches for these various forms of alopecia. The method utilizes a standard gel imager to obtain and process images of mice, measuring the light absorption, which occurs in rough proportion to the amount of black (or gray) hair on the mouse. Data that has been quantified in this fashion can then be analyzed using standard statistical techniques (i.e., ANOVA, T-test). This methodology was tested in mouse models of chemotherapy-induced alopecia, alopecia areata and alopecia from waxing. In this report, the detailed protocol is presented for performing these measurements, including validation data from C57BL/6 and C3H/HeJ strains of mice. This new technique offers a number of advantages, including relative simplicity of application, reliance on equipment which is readily available in most research laboratories, and applying an objective, quantitative assessment which is more robust than subjective evaluations. Improvements in quantification of hair growth in mice will improve study of alopecia models and facilitate evaluation of promising new therapies in preclinical studies.

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including as a side-effect of chemotherapy. We have developed a method to quantify hair loss in mice, utilizing a standard gel imager to perform a grayscale analysis, to facilitate study of promising new alopecia therapies.

Eine neue Technik zur quantitativen Analyse von Haarausfall in Mäuse mit Graustufen-Analyse

Alopecia is a common form of hair loss which can occur in many different conditions, including male-pattern hair loss, polycystic ovarian syndrome, and ...

A Web Tool for Generating High Quality Machine-readable Biological Pathways

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological information. The pathways generated by this online application are machine-readable and fully compatible with essentially all web-browsers and computer operating systems. It uses a specially developed, web-enabled pathway drawing interface that permits the selection and placement of different combinations of pre-drawn biological or biochemical entities to depict reactions, interactions, transport processes and binding events. This palette of entities consists of chemical compounds, proteins, nucleic acids, cellular membranes, subcellular structures, tissues, and organs. All of the visual elements in it can be interactively adjusted and customized. Furthermore, because this tool is a web server, all pathways and pathway elements are publicly accessible. This kind of pathway &#34;crowd sourcing&#34; means that PathWhiz already contains a large and rapidly growing collection of previously drawn pathways and pathway elements. Here we describe a protocol for the quick and easy creation of new pathways and the alteration of existing pathways. To further facilitate pathway editing and creation, the tool contains replication and propagation functions. The replication function allows existing pathways to be used as templates to create or edit new pathways. The propagation function allows one to take an existing pathway and automatically propagate it across different species. Pathways created with this tool can be &#34;re-styled&#34; into different formats (KEGG-like or text-book like), colored with different backgrounds, exported to BioPAX, SBGN-ML, SBML, or PWML data exchange formats, and downloaded as PNG or SVG images. The pathways can easily be incorporated into online databases, integrated into presentations, posters or publications, or used exclusively for online visualization and exploration. This protocol has been successfully applied to generate over 2,000 pathway diagrams, which are now found in many online databases including HMDB, DrugBank, SMPDB, and ECMDB.

PathWhiz is a comprehensive, online pathway drawing tool for generating biochemical and biological pathways. It uses publicly accessible databases and easily expandable palettes consisting of pre-drawn pathway components. This protocol describes how to easily build new pathways, replicate and edit existing pathways, and propagate previously drawn pathways to different organisms.

Ein Web-Tool für die Erstellung hochwertiger maschinenlesbare biologische Pathways

PathWhiz is a web server built to facilitate the creation of colorful, interactive, visually pleasing pathway diagrams that are rich in biological ...

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser capture microdissection (LCM) procedure. Since LCM studies work with low amounts of material, concerns about limited RNA yields are also important. Therefore, an LCM protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The effect of staining protocol, thickness of cryosections, microdissected tissue quantity, RNA extraction kit, and LCM system used on RNA yield and integrity obtained from microdissected bone cells was evaluated. Eight-&#181;m-thick frozen bone sections were made using an adhesive film and stained using a rapid protocol for a commercial LCM stain. The sample was sandwiched between a polyethylene terephthalate (PET) membrane and the adhesive film. An LCM system that uses gravity for sample collection and a column-based RNA extraction method were used to obtain high quality RNAs of sufficient yield. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study in situ gene expression in cells of any hard tissue in both physiological conditions and disease processes.

A laser capture microdissection (LCM) protocol was developed to obtain sufficient quantity of high-quality RNA for gene expression analysis in bone cells. The current study focusses on mouse femur sections. However, the LCM protocol reported here can be used to study gene expression in cells of any hard tissue.

Ein Laser Capture Microdissection Protocol, das hochwertige RNA aus frisch gefrorenen Mausknochen liefert

RNA yield and integrity are decisive for RNA analysis. However, it is often technically challenging to maintain RNA integrity throughout the entire laser ...