In diesem Video bieten wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Sammeln von Fledermäusen in einer humanen Weise, um die Auswirkungen auf die Populationen zu minimieren und den wissenschaftlichen Wert zu maximieren. Die Vorteile unseres Ansatzes sind, dass wir die Menge potenzieller molekularer und morphologischer Daten für jede Fledermaus maximieren, Gewebe erhalten, um ihren zukünftigen Wert zu behalten, und die Ernte wildlebender Individuen minimieren. Sezierprotokolle sind schwer verbal zu demonstrieren.
Viele der Gewebevorbereitungstechniken, die wir hier präsentieren, werden am besten durch die Visualisierung vermittelt, wie verschiedene Organe identifiziert und dann richtig seziert und gespeichert werden. Bereiten Sie alle Durchstechflaschen vor, bevor Sie mit den Sezierungen beginnen, um Verzögerungen zu vermeiden. Legen Sie für RNA die Anzahl der Fläschchen beiseite, die für jede Probe benötigt werden.
Beschriften Sie jedes Rohr mit dem gesammelten Gewebetyp sowie Standard-Probenidentifikationsinformationen. Füllen Sie die Fläschchen 50% voll von RNA-Stabilisierungslösung, und kühlen Sie auf vier Grad Celsius. Achten Sie darauf, die Durchstechflaschen nicht vollständig mit RNA-stabilisierungslösung zu füllen, da die Röhre explodieren kann, wenn sie in flüssigen Stickstoff platziert wird.
Unmittelbar nach der Euthanasie, führen Sie die Enthauptung der Fledermaus Probe, wie im Textprotokoll beschrieben. Haut den Schädel aus den Haaren, Faszien und Schädelmuskeln, einschließlich der Haut auf der Nase. Achten Sie darauf, das vordere Ende der Nase nicht zu brechen.
Entfernen Sie die Augen mit Zange, mit starker genug Kraft, um den Sehnerv zu lösen. Legen Sie die Augen in eine zwei Milliliter Durchstechflasche mit RNA-Stabilisierungslösung. Verwenden Sie eine Schere, um einen sagittalen Schnitt auf dem dorsalen Teil des Schädels beginnend am Hals zu machen, wobei darauf geachtet wird, das Gehirn nicht zu beschädigen.
Dann verwenden Sie Zangen, um sanft beide Seiten des Schädels zurückzuziehen, bis es aufgerissen wird, um das Gehirn freizulegen. Stellen Sie sicher, dass der Schädel des Schädelendes entfernt wurde, so dass Zangen das Gehirn leicht wegkratzen können. Kratzen Sie das Gehirn vorsichtig mit Zangen.
Das Gehirn wird sehr weich sein. Die olfaktorische Glühbirne wird sichtbar, sitzend am ventralen Teil des Inneren des Schädels. Versuchen Sie, die Olfaktor-Lampe anhängen zu halten.
Halten Sie die Gehirnform nach Möglichkeit intakt und legen Sie sie sofort auf Trockeneis oder in eine fünf Milliliter-Durchstechflasche mit RNA-Stabilisierungslösung. Am kaudalen Ende des Schädels sollte die Cochlei nun seitlich auf jeder Seite des Kopfes sichtbar sein. Verwenden Sie Zangen, um die Cochlei sanft zu ziehen.
Dann legen Sie sie in eine Zwei-Milliliter-Durchstechflasche mit RNA-stabilisierungslösung. Machen Sie zwei Einschnitte, wo der obere und untere Kiefer verbinden, und entfernen Sie den Unterkiefer. Die Krippenplatte wird sichtbar.
Dies ist ein kritischer Knochen, um den Forscher orientiert zu halten. Es kann als die vordere Region des Schädels identifiziert werden, mit mehreren Foramen und mit zwei Rillen, wo die Riechbirne ruht. Sobald der Unterkiefer entfernt wurde, entfernen Sie die Tribüne aus dem verbleibenden Teil des Schädels.
Stellen Sie sicher, dass der Kiefer die Cribriform-Platte enthält. Legen Sie die Nase in RNA-Stabilisierungslösung, und lagern Sie bei vier Grad Celsius über Nacht. Aus dem unteren Unterkiefer die Zunge mit der Schere schneiden und in eine zwei Milliliter-Durchstechflasche mit RNA-Stabilisierungslösung legen.
Legen Sie die Nasendurchstechflasche in flüssigen Stickstoff nach dem über Nacht einweichenden in RNA-Stabilisierungslösung. Nach 24 Stunden Einweichen auf Eis oder im Kühlschrank die Proben in flüssigen Stickstoff geben. Verwenden Sie ein Skalpell, um durch die Bauchhöhle zu durchbohren, so dass ein Längsschnitt bis zu den Rippen.
Dadurch verfällt der Skelettrahmen. Entfernen Sie die Haut, um den Brustmuskel zu offenbaren, und nehmen Sie mindestens zwei Proben von Muskel. Gewebe für RNA und DNA werden während dieser Abschnitte gesammelt.
Legen Sie Gewebe für hochmolekulare DNA in trockene Kryovials und blitzen Sie in flüssigem Stickstoff ein. Legen Sie Gewebe für RNA in rnastabilisierende Lösung. Schneiden Sie durch das Brustbein, und ziehen Sie die Rippen weg.
Holen Sie sich nun die Lunge und das Herz. Verwenden Sie das Skalpell und Zange, um das Herz von der Lunge zu trennen. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Lunge aufzubrechen, und legen Sie in RNA-Stabilisierungslösung.
Sammeln Sie das Herz, das ganz eingenommen werden kann, sollte aber in Hälften geschnitten werden, so dass die RNA-Stabilisierungslösung gründlich einweicht. Nehmen Sie nun Proben aus der Leber. Nehmen Sie mindestens zwei Proben von Leber.
Legen Sie eine Probe in eine Durchstechflasche, um für DNA mit hohem Molekulargewicht eingefroren zu bleiben, und legen Sie die andere Probe in eine RNA-stabilisierungslösung. Folgen Sie dem Leberkanal, um die Bauchspeicheldrüse und Gallenblase zu finden. Übertragen Sie die Gallenblase in eine Durchstechflasche mit RNA-stabilisierungslösung.
Finden Sie den Magen, und die federartige Milz an ihrer Basis, erscheint als ein anderer Farbton von lila. Die Bauchspeicheldrüse sollte hier auch als Gewichtsstruktur sichtbar sein. Sammeln Sie den Magen, die Milz und die Bauchspeicheldrüse, in den entsprechenden Fläschchen der RNA-Stabilisierungslösung.
Sammeln Sie kleine Proben des Kleinen und Dickdarms. In die jeweiligen Durchstechflaschen der RNA-stabilisierungslösung geben. Nehmen Sie eine der Nieren, und folgen Sie ihren Kanälen zur Blase, dann in den jeweiligen Fläschchen der RNA-Stabilisierungslösung platzieren.
Verwenden Sie die andere Niere als Leitfaden, um die Hoden zu finden, wenn männlich, oder Gebärmutter und Eierstöcke, wenn weiblich. Sammeln Sie eine oder beide Gonaden, wenn möglich. Nehmen Sie auch Proben von verschiedenen Teilen der Haut des Flügels, und halten Sie in separaten Fläschchen.
Der Hauptvorteil unseres Ansatzes besteht darin, dass er es uns ermöglicht, Tiere auf nicht-tödliche Weise zu beproben, während wir dennoch genügend Material für genomische Studien sowie funktionelle molekulare Studien generieren. Unser Protokoll ermöglicht die Herstellung von primären Fibroblasten aus Flügelgewebe. Die Zellen stellen eine wertvolle erneuerbare Quelle von genetischem Material dar, sowie ein Modell für funktionelle und molekulare Explorationen bei Fledermäusen.
Flügelclips, die gemäß Abschnitt 6 des geschriebenen Protokolls in Wachstumsmedien erhalten geblieben sind, sollten in die Gewebekultureinrichtung übertragen werden. Übertragen Sie den Inhalt des Rohres in ein 15 Milliliter konisches Zentrifugenrohr. Für diese Demonstration wird die Flügelmembranbiopsie verwendet.
Entfernen Sie vorsichtig das Wachstumsmedium. Waschen Sie die Biopsie zwei Mal mit 500 Mikroliter sterilem PBS. Fügen Sie 500 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Kollagenase vier in die Röhre.
Dies wird zu einer Verdauung des Gewebes in einzelne Zellen führen. Über Nacht bei 37 Grad Celsius ohne Aufregung inkubieren. Machen Sie am zweiten Tag ein frisches Wachstumsmedium und erwärmen es auf 37 Grad Celsius.
Bereiten Sie eine sechs Brunnengewebe-Kulturplatte vor, indem Sie zwei Milliliter frisches vorgewärmtes Wachstumsmedium in jedem zu verwendenden Brunnen der Platte hinzufügen. Bewahren Sie diese Platte in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator auf, bis es nötig ist. Entfernen Sie die 15 Milliliter Tube, die die Zellen enthält, aus dem Inkubator, und löschen Sie die Verdauungsreaktion, indem Sie ein Milliliter frisches Wachstumsmedium hinzufügen.
Setzen Sie die Zellen wieder aus, indem Sie die Lösung sorgfältig mit einer P1000 Pipettenspitze trituieren, um eine Einzelzellsuspension zu erreichen. Drehen Sie die Zellen in einer Tischzentrifuge drei Minuten lang bei 300-fachem G.Discard den Überstand vorsichtig herunter, indem Sie 80 bis 90% der Flüssigkeit mit einer P1000 Pipette vorsichtig entfernen. Setzen Sie das Pellet in 500 Mikroliter vorgewärmtem Wachstumsmedium aus.
Die Suspension wird vorsichtig trituieren, um sicherzustellen, dass das Pellet nicht mehr sichtbar ist und dass die Zellen ausreichend suspendiert sind, um kleine Gewebestücke zu vermeiden, die an den Wänden noch sichtbar sein können. Das gesamte Volumen der Zellsuspension vorsichtig in einen einzigen Brunnen der sechs zuvor vorbereiteten Wellplatte, die die Vorwärme-Wachstumsmedien enthält, wird vorsichtig pipet. Schaukeln Sie die Platte zwei- bis dreimal von Seite zu Seite und von vorne nach hinten, um Zellen zu helfen, sich in einer einzigen Schicht über die Brunnenoberfläche zu verteilen.
Überprüfen Sie die plattierten Zellen unter dem Mikroskop. Es sollten einzelne Zellen sein, die aufundballet und schwebend erscheinen, aber sehr dicht. Legen Sie die Platte vorsichtig in einen Inkubator voreingestellt auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Nach ca. 24 Stunden beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um den Zustand der Kultur zu bestimmen. Zellen sollten nun an der Plattenoberfläche befestigt werden und abgeflacht erscheinen. Halten Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator voreingestellt auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Zellen sollten regelmäßig unter dem Mikroskop beobachtet werden, um den Bedarf an Medienerfrischung oder -spaltung zu bestimmen. Wenn nötig, saugen Sie vorsichtig etwa 50% des Mediums aus dem Brunnen, und fügen Sie vorsichtig einen Milliliter vorgewärmten Wachstumsmedium zur Seite des Brunnens, um die Zellen nicht zu stören. Wenn es notwendig ist, die Zellen zu durchziehen, saugen Sie vorsichtig etwa 90% des Wachstumsmediums an.
Waschen Sie die Zellen sehr sanft, indem Sie einen Milliliter sterilen PBS an die Wand des Brunnens, um die Zellen nicht zu stören. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig hin und her und zwei- bis dreimal von Seite zu Seite. Alle PBS vorsichtig von der Platte absaugen, bevor sie die Zellen wieder waschen.
Trypsin EDTA in den Brunnen geben und die Platte sanft schaukeln, um die gesamte Oberfläche des Brunnens mit Trypsin EDTA zu bedecken, und 1,5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Quench die Reaktion durch Zugabe von einem Milliliter frisch vorgewärmte Wachstumsmedium. Pipette nach oben und unten etwa fünf Mal, um die Zellen von der Oberfläche der Platte zu waschen, und stellen Sie sicher, dass die Zellen in Suspension sind.
Legen Sie die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Rohr und drehen Sie die Zellen drei Minuten lang in einer Tischzentrifuge bei 300-fachem G.Discard the supernatant by gently removing 80 to 90 percent of the liquid with a P1000 pipette. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter vorgewärmtem Wachstumsmedium aus, und trituieren Sie die Suspension sanft. Stellen Sie sicher, dass das Pellet oder große Fragmente des Pellets nicht mehr sichtbar sind und sich die Zellen in einer Einzelzellsuspension befinden.
Um die Zelle mit einem automatisierten Zellzähler zu zählen, mischen Sie ein zehn Mikroliter Aliquot der suspendierten Zellen eins zu eins mit Trypan blau, um lebensfähige Zellen zu erkennen. Eine Minute inkubieren und 10 Mikroliter der Lösung auf den Zählschlitten liefern. Fügen Sie die Zählfolie in einen automatisierten Zellenzähler ein, um die Zellen mit den entsprechenden Einstellungen zu zählen.
Bereiten Sie Gefriermedien vor, indem Sie Wachstumsmedium mit DMSO kombinieren, um eine endgültige Konzentration von 10% DMSO zu erhalten. Das Pellet sollte aus einem 80 bis 90%igen Konfluentbrunnen einer sechs Brunnenplatte hergestellt werden. Das Pellet in anderthalb Milliliter Gefriermedium wieder aufhängen.
Legen Sie ca. 750 Mikroliter Zellsuspension in zwei separate Kryovials. Legen Sie die Fläschchen in einen kryogenen Gefrierbehälter, so dass die Zellen langsam einfrieren, um die Vitalität der Zelle zu erhalten. Sofort bei minus 80 Grad Celsius platzieren.
Um die gefrorenen Zellen aufzutauen, bereiten Sie eine sechs Brunnenplatte mit zwei Millilitern vorgewärmtem Wachstumsmedium in jedem Brunnen vor, der verwendet wird. Halten Sie die Platte in der 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator, bis erforderlich. Nehmen Sie eine Durchstechflasche mit Zellen aus flüssigem Stickstoff und legen Sie sie in ein warmes Wasserbad, um die Zellen schnell aufzutauen.
Dies sollte zwei bis drei Minuten dauern. Sobald die Lösung in der Durchstechflasche aufgetaut ist, pipette nach oben und unten, um die Lösung zu homogenisieren, und sofort die gesamte Lösung in einem Brunnen der sechs Brunnenplatte platzieren. Schaukeln Sie die Platte zwei- bis dreimal von Seite zu Seite und von vorne nach hinten, um Zellen zu helfen, sich in einer einzigen Schicht über die Brunnenoberfläche zu verteilen.
Stellen Sie die Zellen im Inkubator bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid für 24 bis 48 Stunden. Überwachen und durchforsperen Sie die Zellen, wie gezeigt. Repräsentative Ergebnisse der DNA-Extraktion enden für Standard-DNA-Analysen von drei Fledermausarten.
Ein einzelnes großes Band weist auf eine minimale Fragmentierung und ähnlich große DNA-Fragmente aus jeder einzelnen Extraktion hin. Ein gemeinsamer Erfolgsindikator für RNA-Extraktionen ist die RNA-Integritätsnummer (RIN) mit Werten über acht, die eine hohe Qualität in Takt-RNA darstellen. Gezeigt werden rIN-Werte von RNA-Extraktionen von 13 verschiedenen Gewebetypen neotropischer Fledermausarten, die an vier verschiedenen Orten beprobt werden.
Gewebe, das von Arten in den Anden, Costa Rica und der Dominikanischen Republik abgetastet wurde, wurden nach dem Einweichen in RNA-Stabilisierungslösung bei vier Grad Celsius über Nacht direkt in flüssigen Stickstoff gegeben. Gewebe, die von Arten im Amazonas gebietiert wurden, wurden etwa eine Woche nach dem Platzieren einer RNA-Stabilisierungslösung in flüssigen Stickstoff gehalten und kontinuierlich bei vier Grad Celsius gehalten. Auch in solchen Fällen waren rIN-Werte mit denen vergleichbar, die sofort in RNA-Stabilisierungslösung und direkt in flüssigen Stickstoff gelegt wurden.
Nach der Gewebekultur sollten Fledermauszellkulturen 80 bis 90 % der Plattenoberfläche abdecken und ihre ursprüngliche Morphologie beibehalten. Dies stellt die optimale Phase für die Aufteilung dar. Nach mehr als sechs Passagen ändern Zellen ihre Morphologie, um größer und länger zu werden, und die Zellen treten in die Seneszenz ein.
Helle aufgeballte Zellen stellen abgestorbene Zellen dar. Zellen in der Kultur stellen eine erneuerbare Quelle von Material dar, wie DNA, RNA und Protein. Diese Zelllinien können eingefroren werden und stellen so eine Ressource dar, die über viele Jahre forschung genutzt werden kann.
Dies ermöglicht genomische, transkriptomische und funktionelle Studien, die mit Primärgewebe närzuzieren werden. Beispielsweise können Zellen genetisch oder chemisch verändert werden, um Effekte auf zelluläre Phänotypen zu beobachten.
