A optogenética tem sido usada para alcançar títulos mais elevados de vários produtos químicos e proteínas em comparação com os indutores típicos. Usando este protocolo, outros podem melhorar seus próprios processos com controle baseado em luz. O controle optogenético não é invasivo, altamente afinado e reversível.
Essas qualidades permitem uma otimização simplificada dos processos microbianos e até mesmo oportunidades únicas, como fermentações trifásicas e controle multifracático. Para qualquer novo produto químico, as condições ideais de luz diferem. Assim, se a baixa produção for observada usando os parâmetros neste protocolo, diferentes condições de luz devem ser testadas.
Comece obtendo uma cepa de saccharomyces cerevisiae com oxitrofia HIS3, um marcador necessário para plasmídeos OptoINVRT. Se procurar controlar um gene nativo de Saccharomyces cerevisiae, certifique-se de que a cópia endógena do gene seja excluída antes de prosseguir. Para iniciar a construção da cepa, linearize o plasmídeo contendo o circuito OptoINVRT7, como o EZL439.
Se usar o EZL439, que contém os componentes para reprimir o promotor PIGA na luz e ativá-lo no escuro, linearize-se no local de restrição do Pme1. Usando métodos padrão de transformação de acetato de lítio, integre o plasmídeo em uma cepa auxotrófica HIS3. Após a transformação, centrifugar as células a 150 G's por um minuto.
Levemente resuspenque as células em 200 microliters de meio SC-HIS fresco. Coloque todo o volume celular em uma placa de ágar SC-HIS e incubar a 30 graus Celsius por dois a três dias até que as colônias apareçam. Prepare células competentes usando protocolos padrão de transformação de acetatos de lítio.
Transforme as células com o plasmídeo contendo os genes que você deseja controlar optogeneticamente a jusante dos promotores PIGA1M ou PIGA1S. Após a transformação, centrifugar a cultura a 150 G's por um minuto e resuspensar suavemente a pelota celular em 200 microliters de sc médio fresco. Plaque o volume inteiro da célula em uma placa de ágardo extrato de levedura, se integrando-se a locais Delta ou uma placa de abandono SC se transformar com um plasmídeo contendo um marcador de seleção.
Incubar as células a 30 graus Celsius por 16 horas sob luz azul constante para manter o gene otogenético controlado reprimido. Use qualquer fonte de luz do comprimento de onda de 465 nanômetros e coloque um painel led aproximadamente 40 centímetros acima da placa de tal forma que a intensidade da luz seja de aproximadamente 80 a 110 micromoles por metro quadrado por segundo. Meça a intensidade usando um medidor quântico.
Se integrar em locais Delta, replique a placa em placas de peptone dextrose de extrato de levedura contendo uma gama de concentrações de Zeocina entre 400 microgramas por mililitro e 1.200 microgramas por mililitro para selecionar para uma variedade de números de cópia de integração. Incubar as placas de réplica a 30 graus Celsius sob luz azul constante ou pulsada por dois a três dias até que as colônias apareçam. Para realizar a triagem preliminar, selecione oito colônias de cada placa e use-as para inocular um mililitro de sc-his médio suplementado com 2% de glicose em poços individuais de uma placa de 24 poços.
Cresça as células durante a noite a 30 graus Celsius tremendo a 200 revoluções por minuto sob iluminação constante de luz azul. No dia seguinte, diluir cada cultura em um novo meio SC-HIS com 2% de glicose para obter os valores de densidade óptica que variam de 0,01 a 0,3 a 600 nanômetros e crescer as culturas em condições de agitação 200 revoluções por minuto sob luz constante ou pulsada a 30 graus Celsius até que a densidade óptica atinja entre dois e nove. Em seguida, enrole as placas com papel alumínio, desligue o painel de luz e incuba as placas no escuro por quatro horas a 30 graus Celsius com 200 revoluções por minuto.
Centrifugar as culturas na placa de 24 poços a 234 G's por cinco minutos e resuspend células em um mililitro de meio de abandono completo sintético fresco com 2%de glicose. Sele as placas para evitar a evaporação do produto desejado usando fita de vedação microplata estéril. Fermente as placas seladas no escuro por 48 horas a 30 graus Celsius tremendo a 200 revoluções por minuto.
Para colher as fermentações, centrifufique as placas por cinco minutos a 234 G's e transfira 800 microlitres do supernatante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Dependendo da química de interesse, analise usando cromatografia líquida de alto desempenho, espectrometria de massa cromatografia gasosa ou outro método analítico utilizando a técnica de preparação da amostra mais adequada para o instrumento utilizado. Selecione oito colônias de cada placa e use-as para inocular um mililitro de meio SC-HIS com 2% de glicose em poços individuais de uma placa de 24 poços.
Cresça as células durante a noite no escuro a 30 graus Celsius com 200 revoluções por minuto tremendo. Na manhã seguinte, diluir cada cultura em um novo meio SC-HIS com 2% de glicose a 0,1 densidade óptica. Enrole as placas em papel alumínio para evitar a exposição à luz e cresça a cultura no escuro a 30 graus Celsius com 200 revoluções por minuto tremendo até atingirem uma densidade óptica de três.
Em seguida, incubar as placas sob luz pulsada por 12 horas a 30 graus Celsius com 200 revoluções por minuto tremendo. Centrifugar as culturas a 234 G's por cinco minutos e resuspensar em sc-his médio fresco com 2%de glicose. Sele as placas para evitar a evaporação do produto desejado usando fita de vedação microplata estéril.
Fermente as placas seladas à luz por 48 horas a 30 graus Celsius tremendo a 200 revoluções por minuto. Após a realização de fermentações optogenéticas, a produção química foi testada em uma série de densidades celulares no momento da indução com dois circuitos. O circuito OptoINVRT7 demonstrou altos títulos de ácido láctico e isobutanol com uma densidade celular ideal de valor de indução de 7,0 e 8,75 em comparação com os circuitos OptoINVRT1 e 2.
As fermentações utilizando os circuitos OptoAMP foram estudadas em três fases definidas por diferentes ciclos de serviço de luz. A produção de ácido láctico pode ser otimizada usando uma fase de crescimento pulsado e fases de indução e produção totalmente iluminadas. A produção de isobutanol foi otimizada usando uma fase de crescimento pulsado, fase de indução totalmente iluminada e fase de produção pulsada.
Considerando que a biossíntese de naringenina foi melhor otimizada usando uma indução totalmente iluminada de crescimento pulsado e fase de produção escura. O sistema OptoLAC tem sido usado em E.Coli para produzir fator de transcrição FDER em títulos comparáveis ou superiores aos alcançados usando indução química com IPDG. Os circuitos OptoLAC foram aplicados para produzir mevalonato e a produção excede os títulos alcançados por indução de IPDG.
A produção de mevalonatos no nível bioreator demonstra a escalabilidade e a sintonia da regulação optogenética para a produção química e proteica em bactérias além dos níveis de microplaca. É importante garantir que a intensidade da luz esteja no alcance adequado para os degraus iluminados e que a contaminação da luz seja evitada para passos que requerem escuridão. Esta técnica abriu o caminho para alcançar títulos recordes de isobutanol na levedura, populações de consórcios estabilizados com luz, e até mesmo controlar o fluxo metabólico usando organelas controladas por luz sintética.
