用于微生物化学和蛋白质生产的光控发酵

与典型的诱导剂相比，光遗传学已被用于实现几种化学物质和蛋白质的更高滴度。使用该协议，其他人可以通过基于光的控制来增强自己的过程。光遗传学控制是无创的，高度可调的和可逆的。

这些品质允许简化微生物过程的优化，甚至开辟独特的机会，如三相发酵和多色度控制。对于任何新的化学品，最佳光照条件都会有所不同。因此，如果使用此协议中的参数观察到低产量，则应测试不同的光照条件。

首先获得具有HIS3氧菌的酿酒酵母菌株，HIS3氧化菌是OptoINVRT质粒所必需的标志物。如果试图控制酿酒酵母的原生基因，请确保在继续之前删除该基因的内源性拷贝。要开始菌株构建，请对含有OptoINVRT7电路的质粒进行线性化，例如EZL439。

如果使用EZL439，其中包含在光线下抑制PIGA一个启动子并在黑暗中激活它的组分，则在Pme1限制位点线性化。使用标准的乙酸锂转化方法，将质粒整合到HIS3营养菌株中。转化后，将细胞以150 G离心一分钟。

将细胞轻轻重悬于200微升新鲜SC-HIS培养基中。将整个细胞体积平板接种到SC-HIS琼脂平板上，并在30摄氏度下孵育两到三天，直到出现菌落。使用标准醋酸锂转化方案制备感受态细胞。

用含有您希望通过光遗传学方式控制 PIGA1M 或 PIGA1S 启动子下游的基因的质粒转化细胞。转化后，将培养物以150 G离心一分钟，并将细胞沉淀轻轻重悬于200微升新鲜SC滴出培养基中。将整个细胞体积接种在酵母提取物蛋白胨葡萄糖琼脂平板上，如果整合到Delta位点或SC滴出板中，如果与含有选择标记物的质粒转化。

在恒定的蓝光下将细胞在30摄氏度下孵育16小时，以保持光遗传学控制的基因受到抑制。使用波长为465纳米的任何光源，并在板上方约40厘米处放置LED面板，使光强度约为每秒每平方米80至110微摩尔。使用量子计测量强度。

如果整合到Delta位点，将板复制到酵母提取物蛋白胨葡萄糖板上，这些板含有一系列沸星浓度，每毫升400微克至每毫升1， 200微克，以选择各种整合拷贝数。将复制板在恒定或脉冲蓝光下在30摄氏度下孵育两到三天，直到菌落出现。要进行初步筛选，请从每个板中选择八个菌落，并用它们在24孔板的单个孔中接种一毫升补充有2%葡萄糖的SC-HIS培养基。

在恒定的蓝光照射下，以每分钟200转的速度在30摄氏度下振荡过夜细胞。第二天，在新鲜的SC-HIS培养基中用2%葡萄糖稀释每种培养物，以获得600纳米处的光密度值范围为0.01至0.3，并在30摄氏度的恒定或脉冲光下以每分钟200转的振荡条件培养培养物，直到光密度达到2至9之间。然后，用铝箔包裹板，关闭灯板，并在30摄氏度下以每分钟200转的速度在黑暗中孵育板四个小时。

将培养物在24孔板中以234 G离心5分钟，并将细胞重悬于一毫升含有2%葡萄糖的新鲜合成完全滴剂中。使用无菌微孔板密封胶带密封板以防止所需产品的蒸发。将密封的板在黑暗中以每分钟200转的速度在30摄氏度下发酵48小时。

为了收获发酵，将板在234 G下离心五分钟，并将800微升上清液转移到1.5毫升微量离心管中。根据感兴趣的化学品，使用高效液相色谱法、气相色谱质谱法或其他分析方法分析，使用最适合所用仪器的样品制备技术进行分析。从每个板中选择八个菌落，并用它们在24孔板的单个孔中接种一毫升含有2%葡萄糖的SC-HIS培养基。

在30摄氏度的黑暗中以每分钟200转的振动将细胞生长过夜。第二天早上，在新鲜的SC-HIS培养基中用2%葡萄糖稀释每种培养物至0.1光密度。用铝箔包裹板以防止暴露在光线下，并在30摄氏度的黑暗中以每分钟200转振荡生长培养物，直到它们达到3的光密度。

然后，在30摄氏度下将板在脉冲光下孵育12小时，每分钟振荡200转。将培养物以234 G离心5分钟，然后重悬于含有2%葡萄糖的新鲜SC-HIS培养基中。使用无菌微孔板密封胶带密封板以防止所需产品的蒸发。

将密封的板在光照下发酵48小时，以30摄氏度的速度以每分钟200转的速度振荡。在进行光遗传学发酵后，使用两个回路在诱导时以一系列细胞密度测试化学生产。与OptoINVRT1和2电路相比，OptoINVRT7电路显示出乳酸和异丁醇的高滴度，其诱导值的最佳细胞密度为7.0和8.75。

使用OptoAMP电路的发酵分三个阶段进行研究，这些阶段由不同的轻型占空比定义。乳酸生产可以使用脉冲生长阶段和完全照明的感应和生产阶段进行优化。异丁醇生产采用脉冲生长阶段、全照射感应阶段和脉冲生产阶段进行优化。

而柚皮素生物合成最好使用脉冲生长全照射诱导和黑暗生产阶段进行优化。OptoLAC系统已用于大肠杆菌中，以与使用IPDG化学诱导实现的滴度相当或高于转录因子FDER的滴度。OptoLAC回路已被应用于生产甲羟戊酸盐，并且产量超过使用IPDG感应实现的滴度。

生物反应器水平的甲羟戊酸盐生产证明了光遗传学调节对微孔板水平以外的细菌中化学和蛋白质生产的可扩展性和可调性。重要的是要确保照明步骤的光强度在适当的范围内，并且对于需要黑暗的步骤，避免光污染。该技术为实现酵母中异丁醇的记录滴度，用光稳定联盟群体，甚至使用合成光控细胞器控制代谢通量铺平了道路。