Оптогенетика была использована для достижения более высоких титров нескольких химических веществ и белков по сравнению с типичными индукторами. Используя этот протокол, другие могут улучшить свои собственные процессы с помощью управления на основе света. Управление оптогенетикой является неинвазивным, легко настраиваемым и обратимым.
Эти качества позволяют оптимизировать микробные процессы и даже открывают уникальные возможности, такие как трехфазные ферментации и мультихроматический контроль. Для любого нового химического вещества оптимальные условия освещения будут отличаться. Поэтому, если наблюдается низкая производительность с использованием параметров в этом протоколе, следует проверить различные условия освещения.
Начните с получения штамма Saccharomyces cerevisiae с окситрофией HIS3, маркером, необходимым для плазмид OptoINVRT. Если вы хотите контролировать ген, нативный на Saccharomyces cerevisiae, убедитесь, что эндогенная копия гена удалена, прежде чем продолжить. Чтобы начать построение деформации, линеаризуйте плазмиду, содержащую схему OptoINVRT7, такую как EZL439.
При использовании EZL439, который содержит компоненты для подавления PIGA одного промотора на свету и активации его в темноте, линеаризуйте в месте ограничения Pme1. Используя стандартные методы трансформации ацетата лития, интегрируйте плазмиду в ауксотрофный штамм HIS3. После трансформации центрифугируйте клетки при 150 G в течение одной минуты.
Аккуратно повторно суспендируйте клетки в 200 микролитрах свежей среды SC-HIS. Нанесите весь объем ячейки на агаровую пластину SC-HIS и инкубируйте при 30 градусах Цельсия в течение двух-трех дней, пока не появятся колонии. Подготовьте компетентные элементы, используя стандартные протоколы трансформации ацетата лития.
Трансформируйте клетки с помощью плазмиды, содержащей гены, которые вы хотите оптогенетически контролировать после промоторов PIGA1M или PIGA1S. После трансформации центрифугируют культуру при 150 Г в течение одной минуты и осторожно повторно суспендируют гранулу клетки в 200 микролитрах свежей выпадающей среды SC. Нанесите весь объем клетки на агаровую пластину из экстракта дрожжей пептона декстрозы, если она интегрируется в дельта-сайты, или на выпадающую пластину SC при преобразовании плазмидой, содержащей маркер выделения.
Инкубируйте клетки при температуре 30 градусов Цельсия в течение 16 часов под постоянным синим светом, чтобы поддерживать подавленный оптогенетически контролируемый ген. Используйте любой источник света с длиной волны 465 нанометров и поместите светодиодную панель примерно на 40 сантиметров над пластиной таким образом, чтобы интенсивность света составляла примерно от 80 до 110 микромолей на квадратный метр в секунду. Измерьте интенсивность с помощью квантового метра.
При интеграции в дельта-сайты реплицируйте пластину на пластины с экстрактом дрожжей пептона декстрозы, содержащие диапазон концентраций цеоцина от 400 микрограммов на миллилитр до 1 200 микрограммов на миллилитр, чтобы выбрать для различных интеграционных номеров копий. Инкубируйте реплики пластин при 30 градусах Цельсия под постоянным или импульсным синим светом в течение двух-трех дней, пока не появятся колонии. Для выполнения предварительного скрининга выберите восемь колоний из каждой пластины и используйте их для прививки одного миллилитра среды SC-HIS, дополненной 2% глюкозой в отдельных лунках пластины из 24 лунок.
Выращивайте клетки в течение ночи при 30 градусах Цельсия, трясясь со скоростью 200 оборотов в минуту при постоянном освещении синим светом. На следующий день разбавьте каждую культуру в свежей среде SC-HIS 2% глюкозой для получения значений оптической плотности в диапазоне от 0,01 до 0,3 при 600 нанометрах и выращивайте культуры в трясущемся состоянии 200 оборотов в минуту при постоянном или импульсном свете при 30 градусах Цельсия, пока оптическая плотность не достигнет от двух до девяти. Затем оберните пластины алюминиевой фольгой, выключите световую панель и высиживайте пластины в темноте в течение четырех часов при 30 градусах Цельсия с 200 оборотами в минуту.
Центрифугируйте культуры в 24-луночной пластине при 234 Г в течение пяти минут и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре свежей синтетической полной выпадения среды с 2% глюкозой. Запечатайте пластины для предотвращения испарения нужного продукта с помощью стерильной уплотнительной ленты для микропластин. Ферментируйте запечатанные пластины в темноте в течение 48 часов при 30 градусах Цельсия, встряхивая со скоростью 200 оборотов в минуту.
Чтобы собрать ферментации, центрифугируйте пластины в течение пяти минут при 234 G и перенесите 800 микролитров супернатанта в 1,5-миллилитрную микроцентрифужную трубку. В зависимости от интересующего химического вещества, анализируйте с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, газовой хроматографической масс-спектрометрии или другого аналитического метода с использованием метода подготовки образцов, наиболее подходящего для используемого прибора. Выберите восемь колоний из каждой пластины и используйте их для прививки одного миллилитра среды SC-HIS 2% глюкозой в отдельных лунках пластины из 24 лунок.
Вырастите клетки на ночь в темноте при 30 градусах Цельсия с 200 оборотами в минуту встряхивания. На следующее утро разводят каждую культуру в свежей среде SC-HIS с 2% глюкозой до 0,1 оптической плотности. Оберните пластины в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить воздействие света и вырастить культуру в темноте при 30 градусах Цельсия с встряхиванием 200 оборотов в минуту, пока они не достигнут оптической плотности в три.
Затем высиживают пластины под импульсным светом в течение 12 часов при 30 градусах Цельсия с встряхиванием 200 оборотов в минуту. Центрифугируйте культуры при 234 г в течение пяти минут и повторно суспендируйте в свежей среде SC-HIS с 2% глюкозой. Запечатайте пластины для предотвращения испарения нужного продукта с помощью стерильной уплотнительной ленты для микропластин.
Ферментируйте запечатанные пластины в свете в течение 48 часов при 30 градусах Цельсия, встряхиваясь со скоростью 200 оборотов в минуту. После выполнения оптогенетических ферментаций химическое производство было протестировано в диапазоне плотностей клеток во время индукции с двумя контурами. Схема OptoINVRT7 продемонстрировала высокие титры молочной кислоты и изобутанола с оптимальной плотностью ячейки значения индукции 7,0 и 8,75 по сравнению со схемами OptoINVRT1 и 2.
Ферментации с использованием схем OptoAMP изучались в три фазы, определяемые различными легкими рабочими циклами. Производство молочной кислоты может быть оптимизировано с использованием импульсной фазы роста и полностью освещенных фаз индукции и производства. Производство изобутанола было оптимизировано с использованием импульсной фазы роста, полностью освещенной фазы индукции и импульсной фазы производства.
В то время как биосинтез нарингенина лучше всего оптимизировать с использованием импульсного роста, полностью освещенного индукции и темной фазы производства. Система OptoLAC была использована в E.Coli для получения транскрипционного фактора FDER на титрах, которые сопоставимы или выше, чем те, которые достигаются с помощью химической индукции с IPDG. Схемы OptoLAC были применены для производства мевалоната, и производство превышает титры, достигнутые с использованием индукции IPDG.
Производство мевалоната на уровне биореактора демонстрирует масштабируемость и настраиваемость оптогенетической регуляции химической и белковой продукции у бактерий за пределами микропластин. Важно убедиться, что интенсивность света находится в правильном диапазоне для освещенных шагов и что световое загрязнение избегается для шагов, требующих темноты. Этот метод проложил путь к достижению рекордных титров изобутанола в дрожжах, стабилизировал популяции консорциумов светом и даже контролировал метаболический поток с помощью синтетических органелл, контролируемых светом.
