The authors thank B. Gruchmann for the mechanical drawings of the flow chamber. Further, we want to express our gratitude to Max Beckers and Florian Drechsler for insightful comments and discussions regarding NPS and the underlying sampling engine.

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The authors have nothing to disclose.

Wir präsentieren das Setup und experimentelle Verfahren zur genauen FRET Effizienzen zwischen Farbstoffen gebunden über flexible Linker an Biomakromolekülen, dh Nukleinsäuren und / oder Proteinen bestimmen. Um präzise Messungen smFRET (Abschnitt 3) zu gewährleisten, ist es wichtig, die Luft aus der Strömungskammer jederzeit während der Messung auszuschließen. Darüber hinaus stellen Sie sicher nicht mit Fluorophore die Strömungskammer zu überlasten. Die Fluorophore müssen klar korrekte Analyse, um sicherzustellen, getrennt werden. Als smFRET Paare, die aus der Analyse ausgeschlossen haben nicht Bleichen des Spenders zeigen werden, stellen Sie sicher, dass&gt; 80% der Moleküle in dem Sichtfeld am Ende des Films gebleicht werden. Zur Berücksichtigung von Inhomogenitäten in der Probe der β-Faktor und der γ-Faktor, die Übersprechen und relative Nachweiseffizienz des Spenders und Akzeptorkanal Korrektur bzw. werden für jede berechnete FRET einzeln koppeln. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Die Kameraeinstellungen (Integrationszeit, Elektronen-Vervielfacher zu gewinnen, in Abschnitt 3.9 beschrieben Vorverstärker Verstärkung und Ausleserate) sollten auf Werte eingestellt werden, um das beste Kompromiss zwischen Signal-Rausch-Verhältnis, Dynamikbereich und Zeitauflösung zu geben. Sie müssen für verschiedene Experimente neu eingestellt werden oder wenn unterschiedliche Hardware verwendet wird. Die Anzahlen von Frames müssen hoch genug sein, um sicherzustellen, dass die meisten der Donatormoleküle bleach innerhalb der Beobachtungszeit. Für die Messungen auf dem Fluoreszenzspektrometer (§§ 7 bis 9) einen guten Kompromiss zwischen der Signalintensität und der spektralen Auflösung der aufgezeichneten Daten hat zu finden. Zu diesem Zweck sind die Schlitze in der Anregungs- und Emissions Weg des Fluoreszenz-Spektrometer müssen abhängig von dem Gerät verwendet werden, angepasst und die Probenkonzentration. Darüber hinaus präsentieren wir die Fast-NPS-Analyseverfahren Strukturinformationen von transienten oder dynamischen macrom zu erhaltenMOLEKULARE Komplexe. NPS wurde den Pfad des Nicht-Template-DNA-Strang und die Position der Transkriptionsinitiationsfaktoren bei der archaealen RNA-Polymerase-Komplex offen zu offenbaren aufgetragen. Mit dem Netzwerk von mehr als 60 verschiedenen Entfernungsmessungen haben wir gezeigt, dass Schnell NPS, ausgestattet mit einem neu implementierten Sampling-Engine (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., &amp; Michaelis, J. in Vorbereitung), reduziert die Zeit für die Analyse dieses komplexen smFRET Netzwerk ≈2 Grßenordnungen erforderlich, da 27 zu dem ursprünglichen globalen NPS - Methode verglichen. Die Robustheit des Algorithmus ist in einer Metropole-in-Gibbs-Sampler mit einem parallelen Temperierung Schema kombiniert verwurzelt. Schnell-NPS zeigt exakte Reproduzierbarkeit von Netzwerk - Ergebnisse und steht im Einklang mit den Ergebnissen früherer 30 veröffentlicht. Mehrere verschiedene Methoden wurden von smFRET Messungen Strukturinformationen zu schließen , veröffentlicht Aiming 11 </snach oben&gt;, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Alle diese Ansätze liefern nur eine spezifische Farbstoff-Modell. So Farbstoffe, die nicht erfüllen, die vom jeweiligen Modell getroffenen Annahmen nicht auf falsche Strukturinformationen verwendet oder führen werden. Fast-NPS, im Gegenteil, kann für jedes Farbstoffmolekül ein anderes Modell auszuwählen. Dies hilft, für unterschiedliche konformative Verhalten beider zu berücksichtigen, das Farbstoffmolekül selbst, sowie der Linker für seine Befestigung verwendet. Die lokalen molekularen Umgebung des Farbstoffmoleküls sowie ihre physikalischen Eigenschaften wird bestimmen, welches Modell am besten geeignet ist. Für den analysierten smFRET Netzwerk des archaeal Initiationskomplex, eine isotrope Annahme für alle Farbstoffmolekülen führt zu einer drastischen Abnahme in die Größe der glaubhafte Volumen als dem klassischen Modell verglichen. In Kombination mit einer dynamischen Position für alle Farbstoffmoleküle im Durchschnitt den Durchschnitt aller glaubhafte Volumengrößen (bei 95%) reduziert sich auf weniger als 0,5 nm 3. Jedoch sind diese Farbstoffmolekül Zähne nicht mehr mit ihren smFRET Messungen, was darauf hinweist, dass die Annahmen führen zu falschen Strukturinformationen gemacht. Im Gegensatz dazu sind die Seitenzähne im klassischen Modell bestimmt in Übereinstimmung mit den ermittelten smFRET Effizienz. Da die Annahme von isotropen und / oder dynamische Position für alle Farbstoffe mit durchschnittlich führen zu Inkonsistenzen, Fast-NPS Farbstoffmolekül priors, in dem ermöglicht jeder Farbstoff eine der fünf Modelle zugeordnet werden können. Jedes Modell verwendet das gleiche Volumen zugänglich. Der Algorithmus für die Berechnung der Farbstoff AVs macht mehrere Annahmen. Zunächst wird die Raumform des Fluorophors wird durch eine Kugel angenähert. Somit nimmt ein Durchmesser-Konto in das wid des Fluorophorsth, Höhe und Dicke sollte (§ 12) verwendet werden. Ferner wird der Linker die Form durch einen flexiblen Stab angenähert. Die dargestellten Werte in § 12 wurden für den Farbstoff Alexa 647 über einen 12-C Linker gebunden berechnet. Bis heute ist es nicht möglich, genau eine priori bestimmen, welches Modell ist am besten geeignet, da eine experimentelle Geometrie und damit alle Modelle getestet werden sollte. In der Regel wird man das Modell zu wählen, das die kleinstmögliche Größe posterior ergibt, während noch im Einklang mit den Daten ist. Um zu testen, ob eine Auswahl an Modellen mit den smFRET Daten konsistent sind, berechnen wir sowohl die hintere und die Wahrscheinlichkeit. Konsistenz bedeutet, dass mehr als 90% der Proben aus dem hinteren gesammelt sind innerhalb des 95% Konfidenzintervalls der Wahrscheinlichkeit. Während es, dass je niedriger die Anisotropie wahr ist, haben je geringer der Abstand Unsicherheit, in einem smFRET Netzwerk geometrische Anordnungen der Farbstoffmoleküle ebenfalls berücksichtigt werden. Somit wird, während representing Farbstoffmoleküle mit einem niedrigen Fluoreszenzanisotropiemessungen mit einem ISO-Modell eine typische erste Wahl ist, stellt der Konsistenzprüfung ein direkteres Mittel für den richtigen Farbstoff Modell auswählen. Die optimale Wahl der Farbstoff-Modelle können zu einer drastischen Erhöhung der Lokalisierungsgenauigkeit führen und zugleich das Netzwerk der Konsistenz mit seinen FRET Daten behalten. Um es zusammenzufassen, Fast-NPS ermöglicht strukturelle und dynamische Informationen von großer makromolekularer Komplexe zu gewinnen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Strukturmethoden wie Röntgenkristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie diese hochflexible oder transiente Komplexe zur Überwachung ermöglicht und damit unser mechanistisches Verständnis komplexer biologischer Prozesse erheblich zu erweitern.

die Struktur eines Biomoleküls Bestimmung ist eine wichtige Voraussetzung für ihre Funktion zu verstehen. Zwei etablierte Methoden zur Strukturbestimmung sind Kryo-Elektronenmikroskopie und Röntgenkristallographie 1, 2. Heute bieten beide Methoden hochauflösende Strukturinformationen mit einer Auflösung bis in den Ångström-Ebene. Diese beiden Methoden wurden ausführlich zu erläutern, die die Struktur großer Biomoleküle wie Protein-Komplexe verwendet. Obwohl die bestehenden Methoden ständig in den letzten Jahrzehnten verbessert worden sind, stellt die Komplexität biologischer Strukturen wie vor eine große Herausforderung für die Strukturbiologie, insbesondere dann , wenn große, dynamische und transiente Komplexe 3 untersucht. Um die Dynamik makromolekularer Komplexe und die Struktur-Funktions-Beziehung insbesondere Einzelmolekülmethoden haben prov zu studierenided nützliche Informationen 4. Mehrere neue Strategien wurden auf den Erwerb von strukturellen und dynamischen Informationen entwickelt eine orthogonale Ansatz bereitstellt. Beispiele dafür sind hohe Geschwindigkeit AFM 5, mechanische Manipulation 6, Fluoreszenzlokalisierungsmikroskopie 7 sowie Einzelmolekül - Förster - Resonanzenergietransfer (smFRET) 8, 9. Da schon früh FRET wurde auf der Längenskala von Biomakromolekülen 10 ein molekulares Lineal, aufgrund der Abstandsabhängigkeit bezeichnet. Eine besonders interessante Anwendung von smFRET ist die Abstandsinformationen aus smFRET Messungen verwenden zu schließen Struktur 11 Informationen, 12, 13, 14, 15 </sup&gt;, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. Aufgrund der hohen Zeitauflösung von smFRET kann die Position der beweglichen Teile einer Proteinstruktur lokalisiert werden. Um jedoch quantitative Informationen aus smFRET Daten wichtig Korrekturparameter über die Farbstoffmoleküle zu extrahieren , müssen während der Messung 24 bestimmt werden. Mit diesen Korrekturfaktoren kann der FRET - Effizienz E FRET berechnet werden unter Verwendung der Formel <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq1.jpg" /> . wo I A und I D </sub&gt; werden die Fluoreszenzintensitäten der Donator und dem Akzeptor - Molekül, die jeweils (siehe Abbildung 2). Die β-factor entfallen Übersprechens, um das Austreten von Donoremission in das Akzeptor-Kanal und wird berechnet durch <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq2.jpg" /> wo ich A und I &#39;D sind die Fluoreszenzintensitäten des Spenders und das Akzeptor - Molekül nach Foto Bleichen des Akzeptor - Molekül. Die γ-Faktor korrigiert die Differenz der relativen Detektionswirkungsgrade in den beiden Kanälen sowie die Unterschiede in der Fluoreszenzquantenausbeute des Donors und dem Akzeptor-Farbstoff. Es wird von jedem einzelnen Zeitverlauf berechnet durch Beachten Sie, dass diese Beschreibung direkte Anregung des Akzeptor-Molekül vernachlässigt, was manchmal wichtig wird und müssten für so gut korrigiert werden. Für diese Korrekturfaktoren bestimmt , ist es sinnvoll , sowohl die Spender als auch als Akzeptor in einem alternierenden Schema 25 , um zwischen den photophysikalischen Veränderungen und Strukturdynamik zu differenzieren zu erregen. Um quantitative smFRET Effizienz nicht nur erhalten , sondern auch quantitative Strukturinformationen, die Nano-Positioning System (NPS) wurde im Jahr 2008 26 eingeführt. Der Name wurde aufgrund seiner Ähnlichkeit mit dem satellitengestützten Global Positioning System (GPS) ausgewählt. Der NPS ist ein Hybrid-Technik kombiniert smFRET und Röntgenkristallographie Daten zur Lokalisierung von unbekannten Farbstoff Positionen in Biomakromoleülkomplexen. Die crystal Struktur dient als Referenzrahmen und die smFRET Ergebnisse werden verwendet , um Entfernungsinformationen zwischen einer unbekannten Fluorophor Position (Antenne) und einer von der Kristallstruktur (Satellit) bekannt erhalten. In aufeinanderfolgenden Experimenten wurden die Abstände zwischen der Antenne und mehreren Satelliten gemessen werden und die Position der Antenne mittels einer statistisch rigorose Analyse Schema bestimmt wird basierend auf Bayesian Parameterschätzung. Als Ergebnis wird nicht nur die wahrscheinlichste Position der Antenne berechnet, aber die komplette 3D Unsicherheitsverteilung, der sogenannte posteriore, glaubwürdige Volumina visualisiert. Außerdem wurde NPS für die Analyse von vollständigen smFRET Netze 27 zu ermöglichen erweitert. Die NPS verwendet wurde eine Reihe von wichtigen Fragen in eukaryotischen Transkription zu lösen, nämlich den Verlauf der vorgeschalteten DNA, die nicht-Matrizen-DNA und dem naszierenden mRNA in der RNA Polymerase II Elongation co12 mplex, 28, auch die Wirkung von Transkriptionsinitiationsfaktoren zeigen 26 und die dynamische Architektur eines offenen Promotorkomplex 29. Darüber hinaus wurde die NPS verwendet , um die Struktur der Archaea - RNA Polymerase offenen Komplex 30 und insbesondere die Position der Transkriptionsinitiationsfaktor TFE zu erläutern, die als Transkriptions - Elongationsfaktor Spt4 / 5 31 kompetitiv an derselben Stelle bindet. Seitdem haben sich eine Reihe von smFRET basierend strukturelle Ansätze veröffentlicht 15, 18, 21, 23. Wenn verschiedene smFRET basierten Strukturmethoden vergleicht, wird deutlich, daß die scheinbare Genauigkeit des Verfahrens auf die besondere Wahl der Farbstoff Modellen in hohem Maße abhängig ist. Man sollte beachten, dassFarbstoffmoleküle Verhalten unterschiedlichen räumlichen und Orientierungs abhängig von ihrer lokalen Umgebung aufweisen. Zu diesem Zweck wurde Schnell NPS 32 eingeführt. Schnell-NPS nutzt eine fortschrittliche Sampling-Algorithmus drastisch die Rechenzeiten zu reduzieren. Des Weiteren, Fast-NPS ermöglicht man eine Strukturanalyse durchzuführen und für jedes Farbstoffmolekül kann der Benutzer aus einem Satz von fünf verschiedenen Farbstoff Modelle wählen, die als nächstes beschrieben wird. Die konservativste Modell, genannt klassisch, geht davon aus, dass der Farbstoff nur eine, sondern unbekannt einnimmt, Stellung. In dieser Position kann das Fluorophor frei drehbar innerhalb eines Kegels, dessen Größe von seiner jeweiligen (zeitabhängige) Fluoreszenzanisotropie bestimmt wird. Die Ausrichtung des Kegels ist nicht bekannt, was zu großen Unsicherheiten führt, wenn gemessen smFRET Effizienzen in Abständen umwandelt. In dieser Hinsicht ist das Modell konservativ, da er auf die kleinste Genauigkeit im Vergleich zu anderen Farbstoffmodus führenls. Nur für sehr kurze Entfernungen sollten die durch das klassische Modell führen zu einer deutlich falsche Positionsbestimmung getroffenen Annahmen. Für typische smFRET Werten wird die richtige Position stets in der vergleichsweise großen glaubhafte umschlossene Volumen. Da jedoch eine höhere Genauigkeit erwünscht ist, ist es wichtig, alternative Farbstoffmodelle zu entwickeln und zu testen, was die Genauigkeit zu verbessern, könnte helfen. Wenn der Farbstoff sehr viel schneller als seine inhärente Fluoreszenzlebensdauer dreht, die sogenannte ISO - Modells angewendet werden kann. Hier wird der Orientierungsfaktor &amp; kgr; 2 (benötigt für die Berechnung der charakteristischen isotropen Förster - Radius <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq4.jpg" /> ) Auf 2/3 gesetzt. Als Ergebnis sind die berechneten glaubhafte Volumina fast zwei Größenordnungen kleiner als im klassischen Modell 32 im Vergleich zu denen. In dem Fall, dass das Fluorophor in einer Umgebung gefunden wird, die nicht nur schnell reori ermöglichtsentation, sondern zusätzlich schnelle Bewegung über seine gesamte zugängliche Volumen, das meanpos-iso - Modell verwendet werden soll. In diesem Modell nimmt der Farbstoff effektiv nur eine mittlere Position, wobei die räumliche Mittelung 15 durch ein Polynom Entfernungsumwandlungs berücksichtigt wird. Dieses Modell gilt , wenn beispielsweise die (allgemein hydrophob) Farbstoff an einen hydrophilen Bereich angebracht ist, beispielsweise der DNA. Anwendung des meanpos-iso - Modell führt zu einer weiteren Reduzierung der Größe der glaubwürdige Volumen um einen Faktor von etwa zwei. Jedoch ist ein Farbstoff an ein Protein gebunden könnte reversibel an mehrere hydrophobe Stellen in seiner sterisch zugänglichen Volumen (AV) binden. Ein Fluorophore , die zwischen diesen Bereichen sofort schaltet, aber innerhalb einer Region Bewegung freie Rotation und schnell lokalisiert erfährt man am besten durch die var-meanpos-iso - Modell beschrieben. Für eine ähnliche Situation , in der der Farbstoff nicht frei , die var-meanpos Modell gilt zu drehen. Mehr d<html> etails über diese Modelle finden Sie in unseren kürzlich erschienenen Publikation 32. Diese Modelle bieten ein umfangreiches Repertoire an speziell Konto für die verschiedenen Umgebungen ein Farbstoff auftreten können und deren Anwendung optimiert weise seine Lokalisierungsgenauigkeit. In der Fast-NPS kann jedes Farbstoffmolekül an eine bestimmte Position an einem einzelnen Modell zugeordnet werden, so dass FRET-Partner verschiedene Modelle haben dürfen. Dies ermöglicht unbegrenzt und in der Nähe zur Natur Modellierung. Allerdings ist es wichtig, dass eine strenge statistische Tests durchführt, um sicherzustellen, dass das Ergebnis durch das endgültige Modell Kombination erhalten wird, ist immer noch in Übereinstimmung mit den experimentellen Daten. Diese Tests werden in der Fast-NPS-Software enthalten. Um eine schnelle-NPS auf experimentelle Daten anzuwenden, um die Messung von (nur) drei Eingangsparameter benötigt. Zunächst wird der Farbstoff-Paar spezifische isotropen Förster Radien (/54782/54782eq5.jpg &quot;/&gt;) Ermittelt werden müssen. Daher ist die Quantenausbeute (QY) des Donor-Farbstoff kann die Donor-Fluoreszenz-Emissionsspektren und die Akzeptor-Absorptionsspektren gemessen werden müssen. Können diese Messungen durchgeführt in bulk, ein Standard - Spektrometer und einer Standardfluoreszenzspektrometer verwendet wird . Für jedes Paar der R 0 wird dann das Freeware PhotochemCAD berechnet und kann in dem NPS - Analyse verwendet werden. Darüber hinaus können die (zeitaufgelöste) Fluoreszenz Anisotropien der Farbstoffmoleküle benötigen erhalten unter Verwendung einer Polarisation (und Zeit) empfindlichen Fluoreszenzspektrometer. Allerdings sind die wichtigsten Eingangsparameter für Fast-NPS sind die smFRET Effizienzen auf einem Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie Einrichtung, wie zum Beispiel ein Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop (TIRFM) gemessen werden . Hier präsentieren wir eine Schritt- für -Schritt - Protokoll für smFRET Daten zu erhalten und die Anwendung Schnell-NPS (Abbildung 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Flowchamber preparation</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Customized metall sample holder</td>
			<td style="width:167px;">self-built</td>
			<td style="width:155px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">quartz-glass slides, 76 x 26 mm</td>
			<td style="width:167px;">Technical Glass Products</td>
			<td align="right">26007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">coverslips, 60 x 24 mm</td>
			<td style="width:167px;">Marienfeld</td>
			<td align="right">101242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">detergent, Hellmanex II</td>
			<td style="width:167px;">Hellma</td>
			<td align="right" style="width:155px;">320.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">ultra-pure water from Synergy UV</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td align="right">2512600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zepto plasma cleaner</td>
			<td style="width:167px;">Diener</td>
			<td style="width:155px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">(3-aminopropyl)-triethoxysilane, p.a.</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">A3648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">methoxy PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa</td>
			<td style="width:167px;">Laysan Bio Inc.</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">biotinylated PEG-succinimidyl valerate, 5 kDa</td>
			<td style="width:167px;">Laysan Bio Inc.</td>
			<td>BIOTIN-PEG-SVA-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Sodium biocarbonate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761 Sigma&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Sodium carbonate</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2127 Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">sealing film (Nescofilm)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12981805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">Tygon Flexible Silicone Tubing, 0.8 mm ID, 2.4 mm OD</td>
			<td style="width:167px;">Saint-Gobain Performance Plastics</td>
			<td align="right">720958</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">Fine-Bore Polyethylene Tubing, 0.58 mm ID, 0.96 mm OD (Smiths Medical)</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right">12665497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Neutravidin</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:155px;">A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Total internal reflection fluorescence microscope</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">Nd:YAG Laser, 532 nm</td>
			<td style="width:167px;">Newport Spectra-Physics</td>
			<td style="width:155px;">EXLSR-532-100-CDRH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">diode-pumped solid-state laser, 491 nm, Calypso</td>
			<td style="width:167px;">Cobolt</td>
			<td align="right" style="width:155px;">904010050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">diode laser 643 nm, iBeam smart</td>
			<td style="width:167px;">Toptica</td>
			<td style="width:155px;">iBEAM-SMART-640-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">dichroic mirror, 532 RDC</td>
			<td style="width:167px;">Chroma</td>
			<td style="width:155px;">F33-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">dichroic mirror, 476 RDC</td>
			<td style="width:167px;">Chroma</td>
			<td style="width:155px;">F33-476z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">acousto-optic tunable filter</td>
			<td style="width:167px;">AA Opto-Electronic</td>
			<td style="width:155px;">AOTFnC-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">plano-convex cylindrical lens, f = 75 mm</td>
			<td style="width:167px;">Thorlabs</td>
			<td>LJ1703L1-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">plano-concave cylindrical, f = -300 mm</td>
			<td style="width:167px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">prism, PS 991</td>
			<td style="width:167px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:155px;">PS991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">focussing lens, f = 75 mm</td>
			<td style="width:167px;">Thorlabs</td>
			<td>LA1608-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">syringe pump, PHD 2000</td>
			<td style="width:167px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:155px;">70-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">2 stepper motors, Z812B</td>
			<td style="width:167px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:155px;">Z812B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">piezoelectric actuator, PE4</td>
			<td style="width:167px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:155px;">PE4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">IR diode laser</td>
			<td style="width:167px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:155px;">CPS808</td>
			<td>part of the autofocus system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">dichroic mirror, 775 DCXR</td>
			<td style="width:167px;">Chroma</td>
			<td style="width:155px;">775 DCXR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">position-sensing detector (PSD), PDP90A</td>
			<td style="width:167px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:155px;">PDP90A</td>
			<td>part of the autofocus system</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:277px;">water-immersion objective, Plan Apo 60X WI, NA 1.2</td>
			<td style="width:167px;">Nikon</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>MRD07601</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">dichroic mirror, 645 DCXR</td>
			<td style="width:167px;">Chroma</td>
			<td style="width:155px;">645 DCXR</td>
			<td>part of the emission pathway</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">emission filter, 3RD550-510</td>
			<td style="width:167px;">Omega Optical</td>
			<td style="width:155px;">3RD550-510</td>
			<td>green channel in the emission pathway</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">emission filter, 3RD660-760</td>
			<td style="width:167px;">Omega Optical</td>
			<td style="width:155px;">3RD660-760</td>
			<td>red channel in the emission pathway</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">EMCCD camera, iXon+ DU897EBV</td>
			<td style="width:167px;">Andor</td>
			<td style="width:155px;">AND-20-00032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">EMCCD camera, iXon3 DU897D-BV</td>
			<td style="width:167px;">Andor</td>
			<td style="width:155px;">AND-20-000141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Miscellaneous</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Varian 50</td>
			<td style="width:167px;">Cary</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>UV-VIS spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Fluorolog2</td>
			<td style="width:167px;">SPEX</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>fluorescence spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Solis (V4.15)</td>
			<td style="width:167px;">Andor</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>control software for the EM-CCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apt user utility&#160; (V1.022)</td>
			<td style="width:167px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>control software for the piezo-motors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Norland Optical Adhesive 68</td>
			<td style="width:167px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>adhesive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC-AFN-0.8 Nile red</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>avidin-coated fluorescent multispec beads&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Matlab</td>
			<td style="width:167px;">Mathworks</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>technical computing language for custon written software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:277px;">Origin (V9.0)</td>
			<td style="width:167px;">Originlab</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>scientific graphing and data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hellma 105-202-15-40</td>
			<td style="width:167px;">Hellma</td>
			<td>105-202-15-40</td>
			<td>absorption cuvette of 1 cm path length</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hellma 105-251-15-40</td>
			<td style="width:167px;">Hellma</td>
			<td>105-251-15-40</td>
			<td>fluorescence cuvette with 3 mm path length</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

structural information from single-molecule fret experiments using the fast nano-positioning system

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. Thereby, multiple smFRET measurements are used to localize an unknown dye position inside a protein complex by means of trilateration. In order to obtain quantitative information, the Nano-Positioning System (NPS) uses probabilistic data analysis to combine structural information from X-ray crystallography with single-molecule fluorescence data to calculate not only the most probable position but the complete three-dimensional probability distribution, termed posterior, which indicates the experimental uncertainty. The concept was generalized for the analysis of smFRET networks containing numerous dye molecules. The latest version of NPS, Fast-NPS, features a new algorithm using Bayesian parameter estimation based on Markov Chain Monte Carlo sampling and parallel tempering that allows for the analysis of large smFRET networks in a comparably short time. Moreover, Fast-NPS allows the calculation of the posterior by choosing one of five different models for each dye, that account for the different spatial and orientational behavior exhibited by the dye molecules due to their local environment.
Here we present a detailed protocol for obtaining smFRET data and applying the Fast-NPS. We provide detailed instructions for the acquisition of the three input parameters of Fast-NPS: the smFRET values, as well as the quantum yield and anisotropy of the dye molecules. Recently, the NPS has been used to elucidate the architecture of an archaeal open promotor complex. This data is used to demonstrate the influence of the five different dye models on the posterior distribution.

Transcription ist der erste Schritt in der Genexpression in allen Organismen. In Archaea, Transkription wird durch einen einzelnen RNA-Polymerase (RNAP) durchgeführt. Im Vergleich zu Eukaryoten trägt der Archaea RNAP eine auffallende strukturelle Ähnlichkeit mit ihren eukaryotischen Kollegen während eine einfachere Transkriptionsmaschinerie hat. Somit kann Archaea als Modellsystem verwendet werden, um eukaryotische Transkriptionsinitiations durch RNA-Polymerase II (Pol II) studieren. Vor kurzem hat die gesamte Architektur der Archaea-RNA-Polymerase offenen Komplex wurde von Einzelmolekül-FRET und NPS bestimmt. Die Daten von NPS-Analyse verwendet wurde, ein Modell des gesamten Archaea offenen Promotorkomplex zu bauen, die nützliche Einblicke in den Mechanismus der Initiation der Transkription zur Verfügung stellt. Um diese Struktur zu verdeutlichen, wurden smFRET Effizienzen zwischen unbekannten Antennenfarbstoffmoleküle gemessen im offenen Promotor com befindetplex und mehrere bekannte Satelliten - Farbstoffmoleküle , die an fünf Referenzstandorte in der RNAP aufgenommen wurden, deren Positionen aus kristallographischen Strukturen bekannt sind (PDB-ID: 2WAQ) 37. Die Antennenfarbstoffe wurden auf der nicht-Matrizen-DNA, um entweder an verschiedenen Positionen angebracht, TFB, TBP oder TFE. Der komplette Netzwerk in dieser Studie verwendet wurde, bestand aus mehr als 60 gemessenen Abstände. 7 zeigt das Modell des kompletten Archaea offenen Promotorkomplex aus dem NPS - Analyse gebaut. Es umfasst die doppelsträngigen Promotor DNA (hell- und dunkelblau), die RNA-Polymerase (grau) und die Transkriptionsinitiationsfaktoren TBP (lila), TFB (grün) und TFE (gelb). Das Modell ist mit den Ergebnissen aus der NPS-Analyse überlagert, die glaubwürdige Bände, die das klassische Modell (A) berechnet wurden, dem ISO-Modell (B), der meanpos-iso-Modell (C), der var-meanpos-iso-Modell (D) und die var-meanpos<html> Modell (E). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig1.jpg" /> Abbildung 1: Workflow der Erfassung und Verarbeitung der Parameter für die Fast-NPS Berechnung benötigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig2.jpg" /> Abbildung 2: Beispielhafte Fluoreszenzintensität Zeitspur eines smFRET Ereignis. Die Fluoreszenzintensitäten des Spenders (grün) und dem Akzeptor-Molekül (rot) für die drei charakteristischen Phasen zeigt, nämlich I: smFRET, II: Donor-Fluoreszenz nach Acceptor Photobleaching, III: Hintergrundfluoreszenz nach Spender Photobleaching.g2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig3.jpg" /> Abbildung 3: Schematische Darstellung der Strömungskammer für smFRET Experimente. Die Strömungskammer ist mit Acrylglashalter auf einem angepassten Metallhalterung montiert. Das Sandwich-Konstruktion der Strömungskammer besteht aus einem Quarzglas (fused silica) mit zwei Löchern zur Befestigung gleiten Eintritts- und Austrittsrohr, eine Siegelfolie und Deckglas, das die Strömungskammer schließt. Das Prisma für TIRF-Beleuchtung auf die untere Hälfte der Strömungskammer montiert. Hohl Registerkarte Schrauben stellen die Ein- und Auslässe für die Strömungskammer. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img<html> alt = &quot;4&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg&quot; /&gt; Figur 4: Herstellung des Quarzglasschieber und dem Dichtungsfilm. Mechanisches Ziehen des Schiebers Quarzglas, die die Positionen der Löcher (angegeben in Millimeter). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig5.jpg" /> Abbildung 5: Mechanische Zeichnung der Strömungskammer. Die Maßnahmen für die Aluminium-Prismenhalter, Acrylglashalter und Aluminium Einbaurahmen sind in Millimeter angegeben. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ild 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg &quot;/&gt; Abbildung 6: Schematische Darstellung der für smFRET Experimente verwendet TIRF - Setup Prisma-Typ ist . Abkürzungen für optische Komponenten: A, Blende; DM, dichroitische Spiegel; F, Emissionsfilter; L, Linse; M, Spiegel; O, Ziel; P, Prisma; PSD, positionsempfindlichen Photodiode; S, Probe; PS, Positioniertischs; T, Teleskop. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig7.jpg" /> Abbildung 7: Simulationsergebnisse der verschiedenen Modellannahmen. Alle Bilder zeigen die Archaea-RNA-Polymerase (PDB-ID: 2WAQ, Ansicht von oben) zusammen mit dem Modell für die Promotor-DNA (tDNA und ntDNA in Blau und Cyan, beziehungsweise), TBP (lila), TFB (grün) und TFE (gelb)in der Archaea öffnen Komplex 30. Die glaubhafte Volumina werden für die NPS Simulationsergebnisse von (A) das klassische Modell, (B) das ISO - Modell, (C) die meanpos-iso - Modell, (D) das Modell var-meanpos-iso lagert und (E) var -meanpos Modell. Alle Bände sind bei 68% Glaubwürdigkeit gezeigt. Die klassische und die var-meanpos Netzwerke stehen im Einklang mit den smFRET Daten. Im Gegensatz dazu Netzwerken, in denen für alle Farbstoffe die iso, meanpos-iso oder die var-meanpos-iso-Modell wird mit den gemessenen Daten inkonsistent gewählt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.

Strukturelle Informationen vom Einzelmolekül-FRET-Experimente unter Verwendung des Fast Nano-Positionierungssystem

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

structural-information-from-single-molecule-fret-experiments-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

12.1K Aufrufe.  Ulm University. We present the setup and experimental procedure to obtain smFRET data from large donor-acceptor networks with a TIRF microscope. The step-by-step analysis of these measurements with the Bayesian inference software Fast-NPS yields high-resolved structural information via the application of adapted dye models.

Serie: Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Forschung

Biochemie

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures and information on more challenging systems. Sample preparation for cryo-EM is undergoing a similar revolution with new approaches being developed to supersede the traditional blotting systems. These include the use of piezo-electric dispensers, pin printing and direct spraying. As a result of these developments, the speed of grid preparation is going from seconds to milliseconds, providing new opportunities, especially in the field of time-resolved cryo-EM where proteins and substrates can be rapidly mixed before plunge freezing, trapping short lived intermediate states. Here we describe, in detail, a standard protocol for making grids on our in-house time-resolved EM device both for standard fast grid preparation and also for time-resolved experiments. The protocol requires a minimum of about 50 &#181;L sample at concentrations of &#8805; 2 mg/mL for the preparation of 4 grids. The delay between sample application and freezing can be as low as 10 ms. One limitation is increased ice thickness at faster speeds and compared to the blotting method. We hope this protocol will aid others in designing their own grid making devices and those interested in designing time-resolved experiments.

Here, we provide a detailed protocol for the use of a rapid grid making device for both fast grid-making and for rapid mixing and freezing to conduct time-resolved experiments.

Schnelle Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

gP2S, an Information Management System for CryoEM Experiments

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has become an integral part of many drug-discovery projects because crystallography of the protein target is not always achievable and cryoEM provides an alternative means to support structure-based ligand design. When dealing with a large number of distinct projects, and within each project a potentially large number of ligand-protein co-structures, accurate record keeping rapidly becomes challenging. Many experimental parameters are tuned for each target, including at the sample preparation, grid preparation, and microscopy stages. Therefore, accurate record keeping can be crucially important to enable long-term reproducibility, and to facilitate efficient teamwork, especially when steps of the cryoEM workflow are performed by different operators. To help deal with this challenge, we developed a web-based information management system for cryoEM, called gP2S. 
The application keeps track of each experiment, from sample to final atomic model, in the context of projects, a list of which is maintained in the application, or externally in a separate system. User-defined controlled vocabularies of consumables, equipment, protocols and software help describe each step of the cryoEM workflow in a structured manner. gP2S is widely configurable and, depending on the team's needs, may exist as a standalone product or be a part of a broader ecosystem of scientific applications, integrating via REST APIs with project management tools, applications tracking the production of proteins or of small molecules ligands, or applications automating data collection and storage. Users can register details of each grid and microscopy session including key experimental metadata and parameter values, and the lineage of each experimental artifact (sample, grid, microscopy session, map, etc.) is recorded. gP2S serves as a cryoEM experimental workflow organizer that enables accurate record keeping for teams, and is available under an open-source license.

gP2S is a web application for the tracking of cryoEM experiments. Its main features are described, as are the steps required to install and configure the application. Once configured, the application allows one to accurately record metadata associated with negative stain and cryoEM experiments.

gP2S, ein Informationsmanagementsystem für KryoEM-Experimente

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has become an integral part of many drug-discovery projects because crystallography of the protein target is not ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

Präzise und genaue Einzelmolekül-FRET-Messungen mit der Open-Source-smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. PRMTs can either mono- or dimethylate arginine guanidino groups symmetrically or asymmetrically. The enzymology of these proteins is a complex and intensely investigated area that requires milligram quantities of high-quality recombinant protein. The baculovirus expression vector system (BEVS) employing Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) and Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insect cells has been used for expression screening and production of many PRMTs, including PRMT 1, 2, and 4 through 9. To simultaneously screen for the expression of multiple constructs of these proteins, including domains and truncated fragments as well as the full-length proteins, we have applied scalable methods utilizing adjustable and programmable multichannel pipettes, combined with 24- and 96-well plates and blocks. Overall, these method adjustments enabled a large-scale generation of bacmid DNA, recombinant viruses, and protein expression screening. Using culture vessels with a high-fill volume of Sf9 cell suspension helped to overcome space limitations in the production pipeline for single batch large-scale protein production. Here, we describe detailed protocols for the efficient and cost-effective expression of functional PRMTs for biochemical, biophysical, and structural studies.

The baculovirus expression vector system (BEVS) is a robust platform for expression screening and production of protein arginine methyltransferases (PRMTs) to be used for biochemical, biophysical, and structural studies. Milligram quantities of material can be produced for the majority of PRMTs and other proteins of interest requiring a eukaryotic expression platform.

Herstellung rekombinanter PRMT-Proteine unter Verwendung des Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the environment, a cell must be able to recognize and process it. This task mainly relies on the function of membrane receptors, whose role is to convert signals into the biochemical language of the cell. G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest family of membrane receptor proteins in humans. Among GPCRs, metabotropic glutamate receptors (mGluRs) are a unique subclass that function as obligate dimers and possess a large extracellular domain that contains the ligand-binding site. Recent advances in structural studies of mGluRs have improved the understanding of their activation process. However, the propagation of large-scale conformational changes through mGluRs during activation and modulation is poorly understood. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) is a powerful technique to visualize and quantify the structural dynamics of biomolecules at the single-protein level. To visualize the dynamic process of mGluR2 activation, fluorescent conformational sensors based on unnatural amino acid (UAA) incorporation were developed that allowed site-specific protein labeling without perturbation of the native structure of receptors. The protocol described here explains how to perform these experiments, including the novel UAA labeling approach, sample preparation, and smFRET data acquisition and analysis. These strategies are generalizable and can be extended to investigate the conformational dynamics of a variety of membrane proteins.

This study presents a detailed procedure to perform single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) experiments on G protein-coupled receptors (GPCRs) using site-specific labeling via unnatural amino acid (UAA) incorporation. The protocol provides a step-by-step guide for smFRET sample preparation, experiments, and data analysis.

Visualisierung der Konformationsdynamik von Membranrezeptoren mit Einzelmolekül-FRET

The ability of cells to respond to external signals is essential for cellular development, growth, and survival. To respond to a signal from the ...

FRET-Analyse der strukturellen Sensitivität von IDR zur Untersuchung von hyperosmotischem Stress in Hefe

Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical properties of the cellular environment change, directly impacting the conformational ensemble of IDRs. IDRs are inherently sensitive to environmental perturbations. Studying how the physicochemical properties of the cell regulate the conformational ensemble of IDRs is essential for understanding the environmental control of their function. Here, we describe a step-by-step method for measuring the structural sensitivity of IDRs in living Saccharomyces cerevisiae cells in response to hyperosmotic stress conditions. We present the use of ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) to estimate how the global dimensions of IDRs change during a progressive increase of hyperosmotic stress imposed on cells with any osmolyte. In addition, we provide a script for processing fluorescence measurements and comparing structural sensitivity for different IDRs. By following this method, researchers can obtain valuable insights into the conformational changes that IDRs undergo in the complex intracellular milieu upon changing environments.

Autor im Rampenlicht: Die Welt der intrinsisch ungeordneten Regionen mit zellulärer Sensorik und Reaktionen erschließen

Intrinsically disordered regions (IDRs) are flexible protein domains that modify their conformation in response to environmental changes. Ensemble fluorescence resonance energy transfer (FRET) can estimate protein dimensions under different conditions. We present a FRET approach to assess IDR structural sensitivity in living Saccharomyces cerevisiae cells under hyperosmotic stress.

Abschätzung der strukturellen Empfindlichkeit von intrinsisch ungeordneten Regionen als Reaktion auf hyperosmotischen Stress in lebenden Zellen mit FRET

Intrinsically disordered regions (IDRs) are protein domains that participate in crucial cellular processes. During stress conditions, the physicochemical ...