Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants GM094246, der American Heart Association Grants 11GRNT7890004, und der National Science Foundation Grant MCB-1110501 unterstützt.

1. Erstellen Sie das Konstrukt, das das Protein von Interesse Klonierung des Gens für das Protein von Interesse exprimieren, in einen geeigneten Vektor. Verwendung Vektoren wie der pcDNA-Reihe oder pRK5 wie sie sind für die Expression in Säugersystemen wie HEK293 und CHO-Zellen geeignet. 2. Wählen Sie die Stellen auf dem Protein mit der Fluorophore markiert werden <ol><li> Wählen Kennzeichnung Websites, die in der Lage, mögliche Konformationsänderungen innerhalb des Proteins widerspiegeln. Wenn möglich, verwenden Sie eine Kristallstruktur des Proteins oder eines homologen Proteins zu helfen, diese Bestimmung. Wenn es keine Kristallstruktur vorhanden, verwenden Sie Online-Software, um die mögliche Struktur des Proteins vorherzusagen und damit erhalten Einblick in geeigneten Standorten. </li><li> Wählen Reste, so dass die Seitenketten der Reste, ausgewählt Oberfläche freigelegt und zugänglich zu den Fluorophoren, so dass das Protein markiert werden. <ol><li> Wählen Rückstände,sind nicht kritisch für die Proteinfunktion, beispielsweise Websites, die nicht an der Ligandenbindung beteiligt sind. </li><li> Bei der Einführung Cystein Mutation bevorzugen Websites, die ähnlich sind, zum Beispiel Serin, die eine minimale Störung der Proteinstruktur führen würde. </li><li> Nach der Auswahl der Markierungsstellen, machen die Mutationen, um sicherzustellen, dass das Protein gibt nur LRET von diesen bestimmt Sites. Verwenden Standardortsgerichtete Mutagenese-Protokolle entfernt mutieren nicht-Disulfid-gebundenen Cysteine, die möglicherweise zu binden könnte Fluoreszenzmarkierungen konjugiert Maleimid. Mutieren nicht weg Disulfid-gebundene Cystein und begraben, freie Cysteine, da sie nicht mit Fluoreszenzfarbstoffen in der gefalteten Form des Proteins reagieren. </li></ol></li><li> Vorstellen Cysteinreste in den gewünschten Stellen, indem Punktmutationen mit Standard-gerichtete Mutagenese-Protokolle. </li><li> Gehören eine Protease-Spaltstelle, die spezifisch spalten kann, die einen der Cysteine ​​von dem Protein. Wenn dieProteinsequenz ermöglicht es, stellen die Website von konservativ Mutation des Proteins, ein Thrombin haben (Erkennungssequenz LVPRGS) oder Faktor Xa (Erkennungssequenz IDGR oder IEGR)-Sequenz in der Nähe des eingeführten Cystein und zugänglich Spaltung Protease; andernfalls kann das Tetra oder Hexa-Peptid-Sequenz als Ganzes eingefügt werden. Wähle die Website, so dass bei der Spaltung einer der eingeführten Cysteine ​​distanziert vom Rest des Proteins in einigen Fällen kann dies erfordern zwei Spaltstellen flankiert, die ein mutiertes Cystein. </li></ol> 3. Testen Sie die Expression und Funktionalität des Proteins <ol><li> Durchführen eines Western-Blot auf die Expression des mutierten Proteins zu bestätigen. </li><li> Eine Funktionstest des Proteins zu gewährleisten, dass die Mutationen die Proteinfunktion nur minimal verändert wird, wenn überhaupt, zu vermeiden Studium Konformationsänderungen eines dysfunktionalen Protein. Hinweis: Da alle Proteine ​​haben verschiedene Funktionen, es gibt keinen einzigen f<html> unctional Test, der speziell für LRET verwendet wird; jedoch einige Beispiele für funktionelle Assays umfassen Enzym-Aktivitätstests für Enzyme, Liganden-Bindungsassays für Rezeptoren und elektrophysiologischen Studien für Ionenkanäle. </li></ol> 4. Wählen Sie die zu verwendenden Fluorophore Wählen Fluorophoren auf der Grundlage der erwarteten Abstandsbereich ist, so dass der Bereich zwischen 0.5-1x R 0 des Fluorophors Paar gemessen. ANMERKUNG: Dies ermöglicht eine einfachere Subtraktion des Hintergrunds, die typischerweise eine wesentlich längere Lebensdauer. Wenn beispielsweise die erwartete Abstandsbereich gemessen etwa 35 Å, ein geeignetes Fluorophor-Paar zu verwenden, würde Terbiumchelat als Donor und Alexa 594 als Akzeptor sein, weil die R 0 für dieses Paar ist 53 Å (Tabelle 1). 5. das Protein durch transiente Transfektion der erforderlichen Menge an Säugerzellen ntent &quot;&gt; transient zu transfizieren, die das Protein von Interesse in der ausgewählten Säugetierzellen mit einem gemeinsamen Transfektionsreagenzien Typischerweise können vier 10-cm-Schalen pro LRET Experiment HEK und CHO-Zelllinien;. jedoch kann diese Menge in Abhängigkeit von der Proteinexpression variieren , Stabilität, etc.. Lassen Sie die Zellen, die das Protein für 36-48 h vor der Ernte auszudrücken. 6. Beschriften Sie die Proteine <ol><li> Lösen Zellen von der Kulturschale. HEK-Zellen zu lösen, indem Sie einfach Pipettieren Puffer gegen den Boden der Schale. Lösen CHO-Zellen mit einem Zellschaber, Abwaschen der Medien mit extrazellulären Puffer. </li><li> Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 1.100 × g für 3 min. Verwenden Sie die gleichen Einstellungen für Zentrifugen Sammeln von Zellen nach der Markierung, als auch nach den nachfolgenden Wäschen. </li><li> Aussetzen Zellen in 3 ml extrazelluläre Puffer, dann fügen Donor und Akzeptor-Fluorophore in äquimolaren Mengen bis zu einer Endkonzentration von 100-300 nM. Inkubieren auf einem Rotor foder 1 h bei RT. </li><li> Diese markierten Zellen 3-4x mit extrazellulären Puffer, um ungebundenen Fluorophore zu entfernen, dann diese Zellen in der extrazellulären Puffer (in der Regel 2 ml) für Messungen LRET auszusetzen waschen. </li><li> Als Kontrolle zu kennzeichnen einen separaten Satz von Zellen mit nur Donorfluorophor (Terbiumchelat) ohne Zusatz eines Akzeptor-Fluorophor. HINWEIS: Die Daten aus diesen Donor-Experimente nur notwendig ist, um die Analyse zu vervollständigen. Diese Versuche können für den gleichen oder verschiedenen Tagen durchgeführt werden. </li><li> Wieder, führen Funktionsvalidierung, dieses Mal mit der Bezeichnung mutierte Protein, wie der Labelling-Verfahren kann auch mit der Funktion abhängig von der Website für die Etikettierung verwendet werden, beeinträchtigt. ANMERKUNG: Diese Experimente können auf der gleichen oder verschiedenen Tagen durchgeführt werden. </li></ol> 7. die LRET Experiment Set <ol><li> Platzieren Sie die resuspendierten Zellen in eine Quarzküvette mit einem Mindestvolumen von 1 ml. </li><li> Einschalten des Computers und des Instruments und die Parameter des DATein Akquisitionsprogramm entsprechend. <ol><li> Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf dem Absorptionsbereich des Donor-Fluorophors (330-340 nm gut für Terbium-Chelat). </li><li> Stellen Sie die Emissionswellenlänge entsprechend, wenn man bedenkt, dass der Akzeptor-Emission hängt von der Akzeptor verwendet wird. Wichtig ist, wählen Sie eine Detektionswellenlänge, die nur die Akzeptor-Emission misst und keine Durchschlagen von Emissions des Spenders enthalten. Verwenden Sie beispielsweise eine Wellenlänge von 565 nm für Alexa 555 als Akzeptor Tabelle 1. Für Donor-nur Messungen, in denen Protein wurde nur mit Spender aber ohne Akzeptor markiert, verwenden Sie eine Wellenlänge von 545 nm zur Messung Terbiumchelat Emission. </li><li> Stellen Sie die Länge des Emissionsdetektion auf mindestens das Dreifache der erwarteten Lebensdauer LRET sein, um sicherzustellen, dass eine lange Lebensdauer-Komponente nicht fehlen. </li></ol></li><li> Führen Sie den Scan. Sie mindestens drei Scans von 99 Sweeps, um die Konsistenz der Ergebnisse zu gewährleisten. Sparen the Ergebnisse als Textdatei (TXT). </li><li> Konformationsänderungen des Proteins im Hinblick auf unterschiedliche Bedingungen (wie die Zugabe eines Liganden) zu messen, zu ändern und diese Bedingungen wieder mindestens drei Abtastungen je 99 Durchläufe durchzuführen auf die gleiche Probe nach diesem neuen Zustand. Wenn die Untersuchung der Auswirkungen von Glutamat auf die Konformation von Glutamat-Rezeptoren, zum Beispiel, fügen Glutamat bis 1 mm zu den gleichen Probe in Schritt 7.3 gescannt und anschließend erneut zu scannen. </li><li> Fügen Sie bis zu fünf Einheiten der entsprechenden Protease und nehmen Scans kontinuierlich, bis die Spaltung abgeschlossen ist und keine weitere Änderung in der Lebenszeit für drei aufeinanderfolgende Scans gesehen. Normalerweise ist die Spaltung in zwei bis 3 Stunden abgeschlossen. Wenn ein Faktor Xa-Spaltstelle, die für Protease-Schnittstelle verwendet, zum Beispiel werden 3 ul Faktor Xa zur Probe und scannen alle 30 min für 3 Stunden. </li></ol> 8. Analysieren Sie die erhaltenen Daten <ol><li> Öffnen Sie die Datenanalyse-Software. </li><li> Laden Sie die FluoreszenzlebensdauerDaten mithilfe von ASCII-Import, um die Text-Dateien zu öffnen. Laden Sie alle Wiederholungen sowie die letzten Hintergrundmessungen, in einer Datei. </li><li> Der Mittelwert der Daten aus allen Scans für jede experimentelle Bedingung, um die endgültigen Daten zu erhalten. Dazu markieren Sie die Spalten, die die einzelnen Studien enthalten, dann unter dem Menü Daten in der Menüleiste, klicken Sie auf Zeilenstatistik, die durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten aus den Prüfungen, sowie die Standardabweichung und Standardfehler anzuzeigen. </li><li> Plotten der Mittelwerte als Liniendiagramm mit der Fluoreszenzintensität auf der Y-Achse und der Lebensdauer in Mikrosekunden auf der X-Achse, um eine Kurve, die die Lebensdauer der sensibilisierten Emission des Akzeptors repräsentiert. Ändern Sie die Y-Achse des Diagramms auf einer logarithmischen Skala, um für eine bessere Visualisierung der Daten zu ermöglichen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 8.3 auf dem Hintergrund von Messdaten, die Mittelung der letzten Scans, die Überlappung zeigen, was eine vollständige Spaltung. </li><li> Zeigen Sie die mittlere Hintergrunddaten auf derelbe Handlung, die den gemittelten Rohdaten enthält. Um dies zu tun, öffnen Sie das Dialogfeld Layer Control unter dem Menü Zeichnen gefunden. Dann übertragen Sie die Daten, die den Hintergrund bedeuten, in die Liste der Layer-Inhalt. </li><li> Richten Sie die mittlere Hintergrunddaten zu den Durchschnitts Rohdaten. Um dies zu tun, verwenden Sie die Funktion Einfaches Mathe unter der Math-Menü zu multiplizieren oder dividieren Sie die Hintergrunddaten wie nötig, bis das hintere Ende des Hinterüberschneidet sich mit dem hinteren Ende der Rohdaten. HINWEIS: Bei dieser Schwanzende, die Lebensdauer von dem Protein von Interesse sollte bereits vollständig abgeklungen ist weg; Was ausgerichtet ist einfach das Hintergrundsignal vorhanden vor und nach Protease-Spaltung. </li><li> Subtrahieren Sie die Hintergrundsignal ausgerichtet von der ersten rohen LRET Signal, wieder unter Verwendung des Simple Math-Funktion. </li><li> Passen die Daten zu einem exponentiellen Abfall (einzelne oder mehrere Exponenten, abhängig von den Standorten und dem experimentellen Design). <ol><li> Stellen Sie die Startgrenze für die Montage nach dem Ende beginnendes Laserpulses. Verwenden Sie diese gleichen Startpunkt für alle nachfolgenden Kurve Armaturen. </li><li> Im Dialogfeld Fit-Funktions, wählen exponentiellen Abfall, um die Lebensdauer der folgenden Gleichung für einen einzigen exponentiellen Abfall passen zu: <img alt="Gleichung 4" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq4.jpg" width="200" /> Gl. 4 wobei die Fluoreszenzintensität repräsentiert y, y 0 die Hintergrund-Intensität aufgrund von Rauschen aus dem System ist, A 1 die Signalintensität, t ist die Fluoreszenzlebensdauer, x die Zeit, und x 0 ist der Zeitversatz. </li><li> Fix x 0-0, starten Sie den Fitting-Funktion, und passen Sie die Daten. HINWEIS: Wenn das Experiment entworfen, um das Signal nur von einem Paar von Websites haben, sollten die daraus resultierenden Daten passen leicht durch einen einzigen exponentiellen Abfall 8 sein. Die Rest der Passform ist eine gute Methode, um die Güte der Anpassung zu bestimmen, und wenn zusätzliche Zerfall Lebensdauern requirHrsg. </li></ol></li><li> Mit den von den Datenlaufzeiten erhalten, den Abstand zwischen Fluorophoren mit der Förster Gleichung (A Umordnung der Gleichungen 1 und 2) zu berechnen: <img alt="Gleichung 5" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq5.jpg" width="200" /> Gl. 5 HINWEIS: Alle Variablen wie oben mit τ DA, die als der sensibilisierten Akzeptor Emissionslebensdauer gemessen wurde erwähnt. Weitere Details und Beispiele von Messungen von R 0 und R 7,9,10 anderswo gefunden werden. </li><li> Versuch wiederholen und Datenanalyse mindestens dreimal, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Inkonsistenz zwischen den einzelnen Wiederholungen der gleichen Messung in Frage, die Gültigkeit der Daten; verwenden Sie zusätzliche Kontrollexperimente oder Wiederholungen. Berechnen Messfehler mit der kostenlosen Gustavus Fehleranalyse-Rechner (von Dr. Thomas Huber entwickelt) oder ein ähnliches System, das den Fehler in der propagiertpasst der Lebensdauer. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

LRET ist eine leistungsfähige Technik, die Wissenschaftler Abstände zwischen Domänen innerhalb eines einzelnen Proteins als auch zwischen Untereinheiten eines multimeren Proteins messen. Als solche LRET auf die Untersuchung der Konformationsänderungen und Dynamik von Proteinen oder anderen Makromolekülen gut geeignet. Das obige Protokoll sollte den entsprechend ausgerüsteten Labor zu ermöglichen, ihre Hypothesen einfach testen; Allerdings gibt es viele gemeinsame Fehlerquellen, die das neue Ermittler plagen könn...

Lumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (LRET) ist ein Derivat des bekannten Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Technik 1. Ähnlich FRET kann LRET verwendet, um Abstände und Abstandsänderungen zwischen Donor und Akzeptor-Fluorophore an spezifische Stellen auf dem Protein von Interesse in dem Bereich von 10-100 Å 1-3 befestigt messen. Die Prinzipien der LRET sind auch ähnlich in dem Resonanzenergietransfer zwischen zwei FRET auftritt proximalen Fluorophore wenn das Emissionsspektrum des Donor-Fluorophors überlappt sich mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptor-Fluorophors. Die Effizienz dieser Übertragung wird der Abstand zwischen den beiden Fluorophoren, die durch die folgende Gleichung in Beziehung: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq1.jpg" width="120" /> Gl. 1 wobei R der Abstand zwischen den beiden Fluorophoren, E die Effizienz der DEEnergietransfer und R 0, wie unten diskutiert, ist der Förster-Radius für den Fluorophor-Paar, dh der Abstand, bei dem die Effizienz der Übertragung ist eine halbmaximale. Aus dieser Gleichung kann man erkennen, dass die Effizienz der Grße des Abstandes zu der inversen sechsten Potenz 1 angesprochen wird. Es ist dieser inversen sechsten Potenz Abhängigkeit, die für FRET-Messungen und LRET ermöglicht außerordentlich empfindlich auch auf kleine Abstandsänderungen, wenn in der Nähe des R 0 des FRET-Paar sein. Die Fähigkeit, spezifisch zu markieren gewünschten Stellen auf Proteinen oder anderen Makromolekülen ermöglicht es, die Vorteile dieser Empfindlichkeit, um Konformationsänderungen zu überwachen. Im Vergleich zu FRET, die herkömmliche organische Farbstoffmoleküle nutzt, bietet LRET zusätzliche Vorteile. In LRET, anstelle der Verwendung eines organischen Farbstoffs als Donor-Fluorophor, einem Lanthaniden-Reihe Kation, typischerweise Tb 3 + oder Eu 3 +, verwendet wird, 1,4-6. Fluorophore, die u fallennder die Kategorie, beispielsweise Terbium-Chelat, sind auch sehr vielseitig, dass sie mit einer Vielzahl von Akzeptor-Fluorophore verwendet werden. Diese Flexibilität ist möglich, weil die Emissionsspektren von Chelat Lanthaniden enthalten mehrere scharfe Emissionsspitzen, so dass für eine einzige Art von Donor-Fluorophor mit einem von einer Vielzahl von Akzeptor-Fluorophore verwendet werden. Somit kann sensibilisierten Akzeptor-Emission ohne Angst vor kontaminierenden Durchbluten von Donoremission 5 detektiert werden. Der Experimentator wählt den spezifischen Akzeptor auf Basis der erwarteten Abstand zwischen den beiden Fluorophoren (Abbildung 1 und Tabelle 1). In dieser chelatisierten Lanthanid Fluorophore, die Metallionen von einem Molekül, das eine Antennengruppe, die in der Regel schlecht absorbierende Lanthanid sensibilisiert als auch als Anregungs bioreaktiven funktionellen Gruppe, um die Ionen auf eine bestimmte funktionelle Gruppe an das Makromolekül anzubinden 1 enthält chelatisierte 5,6. ONCe aufgeregt, Lanthaniden entspannen in den Grundzustand über die Freisetzung von Photonen mit einer Zerfallsrate im Millisekundenbereich. Da der Zerfall weder ein Singulett-Singulett-zu-Entspannung noch eine Triplett-Singulett-zu-Entspannung, die Emission von Photonen nicht richtig Fluoreszenz oder Phosphoreszenz genannt werden, ist jedoch genauer Lumineszenz 1 bezeichnet. Der lange Verfall der Lanthaniden-Lumineszenz hilft sehr bei Lebensdauermessungen. Lebensdauermessungen können dann verwendet werden, um die Effizienz über folgende Beziehung zu bestimmen: <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq2.jpg" width="120" /> Gl. 2 wo E ist die Effizienz der Übertragung, ist τ D die Lebensdauer des Donors (chelatisiert Lanthanid), wenn nicht in der Energieübertragung teilnehmen, und τ DA ist die Lebensdauer des Donors bei der Teilnahme an der Energieübertragung mit dem Akzeptor. Mit LRET, kann τ DA alum so die Lebensdauer der sensibilisierten Akzeptor-Emission gemessen werden, da Terbium Lebenszeit so viel größer ist als die eines organischen Akzeptor-Fluorophor. Der Akzeptor emittiert mit der gleichen Laufzeit wie der Anstiftung Anregung (Donor Lanthaniden) und jeder Beitrag auf die Lebensdauer aus der Akzeptor eigene intrinsische Fluoreszenzlebensdauer ist relativ unbedeutend. Durch Messen der sensibilisierten Emission statt Donoremission wir auch die Notwendigkeit der Kennzeichnung an genau einer 1 zu gewährleisten: 1-Verhältnis von Donor zu Akzeptor. Protein kann statt gleichzeitig mit sowohl Akzeptor und Donor Fluorophoren markiert werden. Eine heterogen markiert Bevölkerung resultieren, aber doppelt Donor markierten Proteine ​​nicht in der Akzeptor-Wellenlänge zu emittieren, und doppelklicken Akzeptor markierten Proteine ​​werden nicht angeregt werden. Darüber hinaus ist der Abstand zwischen Fluorophoren sollte unabhängig von der Cystein-Website eine gegebene Fluorophor isst, insbesondere bei Verwendung der isotropen Lanthanide als Donor gleich sein, so dass der geborened, um eine bestimmte Website, um entweder der Spender oder Akzeptor ist unnötig angeben. Intensität kann mit einer heterogenen Population betroffen sein, aber sollte noch mehr als ausreichend, um erkannt zu werden. Bei der Planung Experimente, sollte die Wahl der Fluorophore von der R 0-Wert des Paares als auch die zu erwartende Reichweite diktiert werden gemessen. Der R 0-Wert wird durch die folgende Gleichung definiert ist: <img alt="Gleichung 3" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq3.jpg" width="250" /> Gl. 3 wobei R 0 der Förster-Radius in Angström, κ 2 der Orientierungsfaktor zwischen den beiden Farbstoffen (gewöhnlich angenommen 2/3 sein), φ D ist die Quantenausbeute des Donors, j die spektrale Überlappungsintegral zwischen Donor ist Emissionsspektrum und Akzeptor des Absorptionsspektrums in M - 1cm -1 nm 4 und n der Brechungsindex des Mediums 1. Unser Labor hat eine Modifikation der herkömmlichen LRET Technik durch die Einführung einer Protease-Erkennungsstelle zwischen dem Donor und Akzeptor-Markierung Stellen auf dem Protein, die geprüft wird zugegeben. Diese Modifikation ermöglicht eine Untersuchung nicht gereinigten Systemen wie ganze Säugerzellen 7. Diese Technik ist besonders nützlich, wenn Cysteine ​​als Stellen für die Kennzeichnung, da in dem Verfahren der Markierung mit Maleimid-konjugierten Farbstoffe, die in Cystein Sulfhydrylgruppen, andere Proteine ​​von den Zellen, die Cysteine ​​auch markiert sind binden. Jedoch, indem Proteasespaltstellen an dem Protein von Interesse und Mess Lebensdauer vor und nach der Spaltung der Experimentator kann quantitativ subtrahiert die Hintergrundsignal nach der Protease-Spalt aus dem Rohsignal. Diese Subtraktion isoliert das spezifische Signal aus dem Protein von Interesse (Figure 2). Unter Verwendung der oben beschriebenen Modifikation kann LRET zur Abstandsänderungen zwischen dem Terbium-Chelat-Donor und dem Akzeptor-Sonde auf einem Protein zu messen und zu kontrollieren, Konformationsänderungen in der Nähe von physiologischen Zustand des Proteins ohne das Erfordernis der Reinigung werden. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Die Absorption und Emissionsspektren von Chelat Terbium in schwarz, sowie einem Vertreter Akzeptor, Alexa 488, rot. Beachten Sie die mehrere Emissionsspitzen und den scharfen, schmalen Emissionsbereich für jeden Höhepunkt der Terbiumchelat. Dieses Muster ermöglicht Terbium, mit einer Vielzahl von Akzeptor-Fluorophore verwendet werden und ermöglicht die Messung der sensibilisierten Emission innerhalb dieser Bereiche, wo Terbium zeigt keine Emission. Terbium der Emissionsmaximum bei 486 nm sehr gut mit der ein überlappt<html> bsorption Spitze des Alexa 488, so dass für Resonanzenergietransfer zwischen den beiden Fluorophoren auftreten. Eine Wellenlänge von 515 nm ist eine ausgezeichnete Wahl an sensibilisierte Emission für dieses Paar zu erkennen, wie es ist im Tal zwischen den Terbium Emissionsspitzen, und ganz in der Nähe des Alexa 488 Emissionsmaximum von 520 nm auf. Beachten Sie, dass die Nähe der Akzeptor-Spitze, obwohl wünschenswert, ist nicht erforderlich-565 nm ist immer noch in der Lage, Alexa 488 Emissions erkennen, ohne auch Erkennen Terbium-Emission. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="374"><tbody><tr height="27"><td height="27" style="height:27px;width:147px;"> Akzeptor-Fluorophor </td><td style="width:45px;"> R 0 (a) </td><td style="width:183px;"> Emissionswellenlänge (nm) </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:147px;"> Atto 465 </td><td align="right" style="width:45px;"> 36 </td>3px; &quot;&gt; 508 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Fluorescein </td><td align="right" style="width:45px;"> 45 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 488 </td><td align="right" style="width:45px;"> 46 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 680 </td><td align="right" style="width:45px;"> 52 </td><td align="right" style="width:183px;"> 700 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 594 </td><td align="right" style="width:45px;"> 53 </td><td align="right" style="width:183px;"> 630 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 555 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 565 </td></tr><trheight = &quot;22&quot;&gt; <td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Cy3 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 575 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Liste der am häufigsten verwendeten Akzeptorfluorophore für LRET mit Terbiumchelat als Donor 11. Die R 0-Werte wurden gemessen, wenn der Donor und Akzeptor wurden dem löslichen Agonisten-Bindungsdomäne von AMPA-Rezeptoren gebunden. Es ist ideal, um die R 0-Wert erneut zu messen für jeden neuen System untersucht. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Eine Übersicht der Verfahren vorgestellt LRET. (A) Die AMPA-Rezeptor ist ein Membranprotein, das Konformationsänderungen bei Ligandenbindungs ​​erfährt. Das Clamshell-förmigen Liganden-binden Domain ist hier rot eingekreist. (B) Das Liganden-bindende Domäne von AMPA als nicht an Proteine ​​gebunden vorliegt in einer offenen Konformation (links). Wenn gebunden an Glutamat Ligand schließt das Protein um seine Liganden (rechts). Durch Anordnen Fluorophore an Beweisstellen auf der LBD kann die Natur dieser Konformationsänderung, wenn der Abstand zwischen den Fluorophoren Änderungen, die dann beeinflussen Fluoreszenzlebensdauer zu sehen. (C) Wenn die Kennzeichnung ganze Zellen, die Kennzeichnung sowohl der Protein von Interesse sowie Hintergrundmembranproteinen auftreten (links). Nach Protease-Schnittstelle, wird LRET Signal aus dem Protein von Interesse durch die Freisetzung eines löslichen Fragment verschwinden, so dass Hintergrundsignal intakt (rechts). Dieses Hintergrundsignal kann dann von dem Ausgangssignal subtrahiert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1394">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:693px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PV3579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F-150</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10254</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20346</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10256</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20344</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">QuantaMaster 3-SS</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the ms range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">FluoreScan 2.0</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Origin 8.6</td>
			<td style="width:223px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Quartz Cuvette</td>
			<td style="width:223px;">Starna Cells, Inc</td>
			<td style="width:119px;">3-Q-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Stir Bar&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Bel-Art Products</td>
			<td style="width:119px;">F37119-0007</td>
			<td>Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence resonance energy transfer to study conformational changes in membrane proteins expressed in mammalian cells

Lumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer oder LRET, ist eine leistungsstarke Technik verwendet, um Abstände zwischen zwei Standorten in Proteine ​​innerhalb der Reichweite von 10-100 Å messen. Durch Messen der Abstände unter verschiedenen Bedingungen ligiert, können Konformationsänderungen des Proteins leicht beurteilt werden. Mit LRET, einem Lanthaniden, meist Chelat Terbium, als Donorfluorophor verwendet, BIETEN Vorteile wie eine längere Donor-Emission nur Lebenszeit, die Flexibilität, mehrere Akzeptorfluorophore zu verwenden, und die Möglichkeit, sensibilisierte Akzeptor-Emission als eine einfache Möglichkeit zu erkennen Energieübertragung ohne das Risiko der auch Donor-Erfassungssignal nur zu messen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur LRET auf Membranproteine ​​exprimiert und auf der Oberfläche von intakten Säugetierzellen getestet verwenden. Wir stellen eine Protease-Schnittstelle zwischen der LRET Fluorophor-Paar. Nach dem Erhalt des ursprünglichen LRET Signal, Spaltung an dieser Stelle entfernt die spezifischen LRET Signal von dem Protein vonInteresse ermöglicht es uns, das Hintergrundsignal, das nach der Spaltung bleibt quantitativ zu subtrahieren. Dieses Verfahren ermöglicht eine physiologisch relevante Messungen ohne die Notwendigkeit für die Reinigung von Protein hergestellt werden.

Eine erfolgreiche LRET Messung mit einem Lanthaniden Spender sollte ein Spender nur Lebenszeit im Millisekunden-Zeitbereich. Die Lebensdauer der sensibilisierten LRET Emission für das Protein sowohl mit dem Spender und dem Akzeptor markiert wird deutlich kürzer sein, mit einer Lebensdauer im Mikrosekundenbereich nach Abzug des Hinter Abbildung 3. Protease-Schnittstelle führt zu einer Erhöhung der Lebensdauer, die stabiler geworden ist im Laufe der Zeit ( dh nicht mehr ändern), die zeigen, ...

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Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Wir beschreiben hier eine verbesserte Lumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (LRET) Verfahren, wo wir eine Protease-Schnittstelle zwischen dem Spender und Akzeptor-Fluorophor Stellen einzuführen. Diese Modifikation erlaubt es uns, spezifische LRET Signale aus Membranproteinen von Interesse, so dass für die Untersuchung von Membranproteinen ohne Proteinreinigung erhalten.

Lumineszenz-Resonanzenergietransfer zu Konformationsänderungen in Membranproteinen in Säugerzellen exprimiert Studieren

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

luminescence-resonance-energy-transfer-to-study-conformational

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.9K Aufrufe.  University of Texas Health Science Center at Houston.  Wir beschreiben hier eine verbesserte Lumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (LRET) Verfahren, wo wir eine Protease-Schnittstelle zwischen dem Spender und Akzeptor-Fluorophor Stellen einzuführen. Diese Modifikation erlaubt es uns, spezifische LRET Signale aus Membranproteinen von Interesse, so dass für die Untersuchung von Membranproteinen ohne Proteinreinigung erhalten. 

Serie: Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

Visualizing Proteine ​​und Makromolekulare Komplexe von Negative Stain EM: von Grid Vorbereitung auf Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Forschung

Biotechnik

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key component of lung development is the differentiation of alveolar type II epithelial cells, the major source of pulmonary surfactant. These cells also participate in fluid homeostasis in the alveolar lumen, host defense, and injury repair. In addition, distal lung parenchyma cells can be directly exposed to exaggerated stretch during mechanical ventilation after birth. However, the precise molecular and cellular mechanisms by which lung cells sense mechanical stimuli to influence lung development and to promote lung injury are not completely understood. Here, we provide a simple and high purity method to isolate type II cells and fibroblasts from rodent fetal lungs. Then, we describe an in vitro system, The Flexcell Strain Unit, to provide mechanical stimulation to fetal cells, simulating mechanical forces in fetal lung development or lung injury. This experimental system provides an excellent tool to investigate molecular and cellular mechanisms in fetal lung cells exposed to stretch. Using this approach, our laboratory has identified several receptors and signaling proteins that participate in mechanotransduction in fetal lung development and lung injury.

Mechanical forces play a key role in lung development and lung injury. Here, we describe a method to isolate rodent fetal lung type II epithelial cells and fibroblasts and to expose them to mechanical stimulation using an in vitro system.

Ein experimentelles System, um Mechanotransduktion in fetalen Lunge Zellen zu untersuchen

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein activity and have diverse roles in many biological processes. For example, SUMO covalently modifies a large number or proteins with important roles in many cellular processes, including cell-cycle regulation, cell survival and death, DNA damage response, and stress response 1-5. SENP, as SUMO-specific protease, functions as an endopeptidase in the maturation of SUMO precursors or as an isopeptidase to remove SUMO from its target proteins and refresh the SUMOylation cycle 1,3,6,7.
The catalytic efficiency or specificity of an enzyme is best characterized by the ratio of the kinetic constants, kcat/KM. In several studies, the kinetic parameters of SUMO-SENP pairs have been determined by various methods, including polyacrylamide gel-based western-blot, radioactive-labeled substrate, fluorescent compound or protein labeled substrate 8-13. However, the polyacrylamide-gel-based techniques, which used the "native" proteins but are laborious and technically demanding, that do not readily lend themselves to detailed quantitative analysis. The obtained kcat/KM from studies using tetrapeptides or proteins with an ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) or AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorophore were either up to two orders of magnitude lower than the natural substrates or cannot clearly differentiate the iso- and endopeptidase activities of SENPs.
Recently, FRET-based protease assays were used to study the deubiquitinating enzymes (DUBs) or SENPs with the FRET pair of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) 9,10,14,15. The ratio of acceptor emission to donor emission was used as the quantitative parameter for FRET signal monitor for protease activity determination. However, this method ignored signal cross-contaminations at the acceptor and donor emission wavelengths by acceptor and donor self-fluorescence and thus was not accurate.
We developed a novel highly sensitive and quantitative FRET-based protease assay for determining the kinetic parameters of pre-SUMO1 maturation by SENP1. An engineered FRET pair CyPet and YPet with significantly improved FRET efficiency and fluorescence quantum yield, were used to generate the CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrate 16. We differentiated and quantified absolute fluorescence signals contributed by the donor and acceptor and FRET at the acceptor and emission wavelengths, respectively. The value of kcat/KM was obtained as (3.2 &plusmn; 0.55) x107 M-1s-1 of SENP1 toward pre-SUMO1, which is in agreement with general enzymatic kinetic parameters. Therefore, this methodology is valid and can be used as a general approach to characterize other proteases as well.

Quantitative FRET F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

A novel method involving quantitative analysis of FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer) signals is described for studying enzyme kinetics. KM and kcat were obtained for the hydrolysis of the catalytic domain of SENP1 (SUMO/Sentrin specific protease 1) to pre-SUMO1 (Small Ubiquitin-like MOdifier). The general principles of this quantitative-FRET-based protease kinetic study can be applied to other proteases.

Quantitative FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse für SENP1 Protease Kinetics Bestimmung

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membran-DORN: Ein Tool, um biochemische Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen Identifizieren<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Ein Protokoll für die Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensoren mechanische Kräfte über den Kern LINC-Komplex zu messen

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Elektrospinnen Schreiben von dreidimensionalen Poly(ε-caprolactone) Gerüste mit steuerbaren Morphologien für Tissue Engineering Anwendungen zu schmelzen

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Kultivierung von Säugerzellen in dreidimensionale Peptid Gerüste

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

Orbital schütteln Kultur von Säugerzellen in O-förmigen Schiffe, einheitliche Aggregate zu produzieren

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationsänderungen unter Scherfluss mit Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...