Das Protokoll beschreibt, wie ein Ionenmobilitätsprofil für die Fragmente, die bei der Aktivierung eines Moleküls im Massenspektrometer erzeugt werden, aufgezeichnet und zwischen isomeren Strukturen unterschieden wird. Das Protokoll ermöglicht es, Glykane in Bezug auf einige ihrer wichtigsten strukturellen Merkmale in 11 Gruppen einzuteilen und somit eine Information bereitzustellen, die sonst schwer zu erhalten ist. Es kann dazu dienen, molekulare Netzwerke aufzubauen, die extrem generisch sind und für viele molekulare Familien geeignet sind, wie Metaboliten oder Medikamente, die in vielen Forschungsbereichen von Interesse sind.
Der Ansatz nutzt ein neues Konzept in der Ionenmobilitätsspektrometrie und wird dort nützlich sein, wo die Massenspektrometrie allein nicht zwischen zwei Strukturen unterscheiden kann. Das Experiment erfordert eine gute Beherrschung der Massenspektrometrie und der Ionenmobilität. Der Experimentator sollte jedoch bei der Implementierung der Methode erfolgreich sein, wenn man jeden der Schritte sorgfältig befolgt.
Das Verfahren wird Simon Ollivier, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Richten Sie zunächst eine Single-Pass-IMS-Sequenz auf der Seite Melodie ein, versetzen Sie das Instrument in den Mobilitätsmodus und öffnen Sie das Fenster Steuerung zyklischer Sequenzen. Wählen Sie in diesem neuen Fenster auf der Registerkarte Zyklische Funktionen den erweiterten Modus aus, wählen Sie Bundle hinzufügen und dann Single/Multipass aus.
Warten Sie, bis eine Abfolge von Mobilitätsereignissen auf der Registerkarte Sequenz desselben Fensters angezeigt wird. Passen Sie die Reihenfolge so an, dass alle Kalibrantenionen einen einzigen Durchgang um die zyklische IMS-Rennstrecke machen. Ändern Sie nicht die Einspritzzeit oder die Auswurf- und Erfassungszeit, sondern senken Sie die Trennungszeit auf eine Millisekunde.
Wenn einige Ionen der Kalibriermischung nicht in das angezeigte Ankunftszeitfenster passen, ändern Sie die Synchronisation des IMS mit dem Pusher des orthogonalen Beschleunigungs-TOF-Analysators, indem Sie die Anzahl der Pushes pro Bin auf der Registerkarte ADC-Einstellungen erhöhen. Um eine zweiminütige Aufnahme im Fenster Steuerung zyklischer Sequenzen aufzuzeichnen, klicken Sie auf Erfassen, um das Popup-Fenster Erfassungseinstellungen zu öffnen, geben Sie den Dateinamen, die Beschreibung und die Länge der Erfassung, Minuten ein und klicken Sie auf Speichern. Schalten Sie das Gerät von der MS Tune-Seite in den TOF-Modus, um die Stabilität des Signals zu überprüfen.
Zeichnen Sie eine vollständige MS-Aufnahme der Probe für eine Minute auf, die nützlich ist, um das Isotopenmuster und das Vorhandensein potenzieller Verunreinigungen zu überprüfen. Versetzen Sie das Instrument über die Registerkarte Quad/MS-Profil der Hauptseite Tune in den MSMS-Modus. Wählen Sie die Masse des Zieleisens im MSMS-Massenfeld für die Isolierung im Quadrupol.
Zeichnen Sie eine einminütige Erfassung auf, um die Vorläuferisolation bei der Verarbeitung der Daten zu überprüfen. Um eine mobilitätsbasierte Auswahl des gewünschten Isomers durchzuführen, schalten Sie das Gerät im Fenster Steuerung zyklischer Sequenzen in den Mobilitätsmodus, wählen Sie auf der Registerkarte Zyklische Funktionen die Option Bundle hinzufügen und dann Slicing aus. Warten Sie, bis auf der Registerkarte Sequenz eine komplexe Abfolge von Mobilitätsereignissen angezeigt wird.
Positionieren Sie das Ereignis Auswerfen und Erwerben direkt nach dem ersten Separate-Ereignis, und klicken Sie dann auf Ausführen. Achten Sie darauf, dass die Ergebnisse der anfänglichen Trennung in Echtzeit angezeigt werden. Erhöhen Sie die Dauer des ersten separaten Ereignisses für eine Multipass-Trennung, indem Sie den Zeitwert für dieses Ereignis in der Sequenz ändern, bis die Auflösung der IMS-Spitzen zufriedenstellend ist.
Notieren Sie eine einminütige Akquisition als Referenz. Klicken Sie auf Pause, und positionieren Sie das Ereignis Auswerfen und Erfassen unter den Ereignissen Auswerfen, Auswerfen in Vorspeicher und Halten und Auswerfen. Passen Sie die Dauer der Ereignisse so an, dass sich der angestrebte Peak im Bereich Auswerfen in den Vorspeicherbereich und jedes andere Ion entweder im Auswurf- oder im Halte- und Auswurfbereich befindet.
Positionieren Sie das Ereignis Auswerfen und Erfassen am Ende der Sequenz unter dem Ereignis Reinject from Pre-Store und dem zweiten Separate-Ereignis. Klicken Sie auf Ausführen, um die ausgewählte Grundgesamtheit anzuzeigen. Überprüfen Sie die Qualität der Isolierung.
Notieren Sie eine einminütige Akquisition als Referenz. Suchen Sie auf der Registerkarte Sequenz in der Spalte neben den benutzerdefinierten Ereigniszeiten nach den summierten Zeiten aller Ereignisse. Beachten Sie die Time Abs, die auf der Linie des Reinject from Pre-Store-Ereignisses für die Durchführung der CCS-Kalibrierung zu finden sind.
Legen Sie die Dauer des Separate-Ereignisses fest, das direkt mit dem Auswerfen und Erfassen fortfährt, auf eine Millisekunde. Aktivieren Sie in der Zeile Reinject from Pre-Store das Kontrollkästchen Aktivierung aktivieren, und optimieren Sie die Fragmentierung mit dem integrierten Steuerelement. Wenn die Fragmentierung mit der integrierten Steuerung nicht zufriedenstellend ist, deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Aktivierung aktivieren und fahren Sie fort, die Reinjektionsspannungen manuell zu optimieren, den Pre-Array-Gradienten zu erhöhen und die Array-Offset-Spannung zu senken, bis die Ergebnisse zufriedenstellend sind.
Um eine zweiminütige Aufnahme im Popup-Fenster "Erfassung" aufzuzeichnen, aktivieren Sie die Option "Driftzeit beibehalten", um eine Datei zu generieren, die nur die Ankunftszeiten enthält, im Gegensatz zu M über Z, das als _dt.raw gekennzeichnet ist. Nach Durchführung der MS-Analyse des Arabinoxylan-Pentasaccharid-Gemisches zeigte das Spektrum ein Isotopenmuster mit einem einzigen Peak bei M über Z 685,24, was darauf hindeutet, dass die beiden Verbindungen isomerer Natur sind. Die Addukte der Pentasaccharide wurden durch die zyklische IMS-Zelle getrennt, und drei Peaks wurden mit unterschiedlichen Ankunftszeiten getrennt.
Der reine XA3XX zeigt die Spitzen bei 83 und 90 Millisekunden, während der XA2XX einen Peak bei 94 Millisekunden aufweist. Nach der ersten Stufe der IMS-Trennung wurden zu XA3XX gehörende Ionen ausgestoßen und der Peak bei 94 Millisekunden für die IMS-IMS-Analyse ausgewählt. Eine Drei-Gang-Trennung wurde durchgeführt, nachdem das Ion ohne Aktivierung wieder injiziert wurde, und ein Peak für XA2XX wurde bei 199 Millisekunden erhalten.
Die generierten IMS-IMS MS-Daten wurden unter Verwendung der Ankunftszeit und der Dimensionen M über Z entwickelt, wodurch die IMS-IMS-Spektren erzeugt wurden. Die Spitzen über 0,2% relativer Intensität wurden für die CCS-Kalibrierung exportiert, was zu einem zentrierten CCS-kalibrierten IMS-IMS-Spektrum führte. Es ist immer wichtig, die Isolierung des Vorläufers zu überprüfen, da sonst das Spektrum aus einer Mischung der interessierenden Verbindung und der Verunreinigungen stammen kann.
Wir haben bisher IMS-IMS-Spektren verwendet, um Netzwerke aufzubauen und Verbindungen zu klassifizieren, aber sie könnten auch verwendet werden, um Datenbanken nach Verbindungsidentifikationen zu durchsuchen. Diese Technik ist sehr neu, aber wir erwarten, dass sie sowohl in Glycomics als auch in jedem Kontext, in dem Analytiker mit isomeren Molekülen konfrontiert werden, äußerst nützlich sein wird.
