Diese neue Technik kombiniert die Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie mit molekularer Modellierung und Reaktionsdynamiktheorie, um die relative Thermochemie zweier konkurrierender Dissoziationsreaktionen eines ternären Komplexes zu bestimmen. Die Kombination dieser Techniken charakterisiert die Reaktionswege der Reaktanten und Produkte, die Konformationsstrukturen und die Affinität des Liganden, einen ternären Komplex mit dem Metallion zu bilden. Diese Forschung modelliert die Reaktivität von zwei potenziellen Peptid-Tags für die rekombinante Proteinreinigung, bei der das Tag mit dem durch Nitrilotriessigsäure chelatierten Metall in einer immobilisierten Metallaffinitätssäule reagiert.
Beginnen Sie mit dem Laden der 2-Milliliter-Probe in eine 2,5-Milliliter-Stumpfnasenspritze und injizieren Sie die Probe mit der Spritzenpumpe des Instruments mit einer Durchflussrate von 10 Mikrolitern pro Minute in das Elektrospray des Geräts. Versetzen Sie das Gerät in den negativen Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie oder IM-MS-Modus. Identifizieren Sie das Masse-zu-Ladungs-Isotopenmuster des negativ geladenen alternativen Metallbindungs-ternären Komplexes oder amb-Metall-NTA-Komplexes, indem Sie das Massenspektrometrieprogramm öffnen und Spektrum auswählen.
Wählen Sie dann Extras und dann Isotopenmodell. Listen Sie im Popup-Fenster die Summenformel des Komplexes auf, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Geladenes Ion anzeigen, geben Sie 1 für die Ladung des negativen eins ein und klicken Sie auf OK.In angezeigten Isotopenmuster des Komplexes, notieren Sie den niedrigsten Massenpeak. Wählen Sie in der Gerätesoftware Setup und dann Quad Profile (Quad Profile) aus.
Wählen Sie dann Manual Fixed (Manuell fixiert) und geben Sie die Masse des niedrigsten Isotopenmusterpeaks ein. Klicken Sie auf Aktualisieren und schließen Sie das Fenster. Wählen Sie erneut Setup und klicken Sie dann auf Resolving Quad.
Sammeln Sie die negativen IM-MS-Spektren des Ions beginnend mit der ersten Transferkollisionsenergie mit einer Laufzeit von 5 Minuten und einer Scanzeit von 2 Sekunden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um die IM-MS-Spektren für jede der anderen Kollisionsenergien zu erfassen. Verwenden Sie die integrierten Ankunftszeitverteilungen oder ATD-Bereiche für den ternären amb-metal-NTA-Komplex und zwei Produkte, NTA-Metallkomplex und amb-Metall-Komplex, um auf eine relative Prozentskala zu normalisieren.
Aus den TCID-Messungen (replicate threshold collision-induced dissociation) werden der Mittelwert und die Standardabweichungen jedes Datenpunkts ermittelt. Wandeln Sie dann die Laborrahmen-Transferkollisionsenergie in die Kollisionsenergie des Massenschwerpunkts um. Um Kollisionsquerschnitte zu messen, sammeln Sie die negativen Ionen-IM-MS-Spektren der 10-ppm-Poly-DL-Alanin- oder PA-Probe für 10 Minuten unter Verwendung der instrumentellen Betriebsbedingungen.
Sammeln Sie dann die IM-MS-Spektren jedes ternären Komplexes für 5 Minuten. Extrahieren Sie die ATD jedes PA- und ternären Komplexes und exportieren Sie ihre Dateien mit der Option Driftzeit beibehalten in die Massenspektrometrie-Software. Ermitteln Sie die durchschnittlichen Ankunftszeiten aus den Maxima der entsprechenden ATD-Kurven.
Verwenden Sie eine Querschnittskalibriermethode, um die durchschnittlichen Ankunftszeiten in Kollisionsquerschnitte des ternären Komplexes umzurechnen. Öffnen Sie im Hauptmenü CRUNCH die GB5-Textdatei, die die Energie des Massenschwerpunkts oder ECM-abhängige relative Intensitäten der Produkte enthält. Antworten Sie mit Nein, um Parameter zu lesen.
Wählen Sie dann Modellierung und anschließend Alle Parameter festlegen. Wählen Sie aus den Reaktionsmodelloptionen die Standardoption Threshold CID gefolgt von RRKM mit Integration über die Energieübertragungsverteilung des ternären Komplexes. Geben Sie 2 für unabhängige modellierte Produktkanäle ein, und wählen Sie Querschnitte berechnen aus.
Wählen Sie für den Typ des unverworrenen Modells den 0-Kelvin-Querschnitt, der die statistische RRKM-Korrektur der kinetischen Verschiebungen aufgrund des 50-Mikrosekunden-Zeitfensters von der Kollisionszelle zum Time-of-Flight-Detektor beinhaltet. Für die Faltungsoptionen wählen Sie das Doppelintegral von Tiernan, das die Faltung über translationale Energieverteilungen zwischen dem ternären Komplexion und dem Argon-Kollisionsgas umfasst. Wählen Sie für die numerische Integrationsmethode Gaußsche Quadratur mit vorgespeicherten Querschnitten.
Geben Sie aus den Optionen zur Eingabe der molekularen Parameter G ein, um die Strukturmodellierungsdatei mit den PM6-Schwingungs- und Rotationsfrequenzen des ternären Komplexes zu lesen. Antwort Ja auf die Frage:Ist einer der Reaktanten atomar? Schreiben Sie den Speicherort und den Namen der Modellierungsdatei.
Geben Sie 1 für die Ladung am Ion und 1,664 für die Polarisierbarkeit des Argongases ein. Die Ionenmasse und die Zielmasse beziehen sich auf den ternären Komplex bzw. Argon und werden automatisch aus der GB5-Textdatei gelesen. Geben Sie 0 für harmonische Schwingungen ein.
Drücken Sie die Eingabetaste, um die 1D- und 2D-Rotationskonstanten aus der Strukturmodellierungsdatei zu lesen. Wählen Sie die Standardwerte 0 für die behinderten Rotorbehandlungen und 1 für die Molekülsymmetrie. Wählen Sie den Standardwert von 300 Kelvin für die Reaktantentemperatur.
Wählen Sie Integration für die Methode zur Reduzierung der Zustandsdichte aus. Wählen Sie Ja, um die Energieverteilung zu kürzen. Geben Sie 40000 Wellenzahl für maximale Energie für die Verteilung, 2 Wellennummer für die Behältergröße und 32 für die Anzahl der Punkte in der Energieverteilung ein.
Wählen Sie für Parameter für das TCID/RRKM-Modell Yes (Ja) für Change (Ja) aus, geben Sie 0 für Fixed Time (Feste Zeit) und 0,000050 Sekunden für die obere Grenze des Erkennungsfensters ein. Wählen Sie für Produktkanal 1 1 für einen einzelnen Übergangszustand aus den Dissoziationskanaloptionen und 0 für keine der sequenziellen Dissoziationen aus. Wählen Sie als Übergangszustandstyp 1 für die Umkreisung aus.
Wählen Sie G, um die Modellierungsprogrammdateien zu lesen, die die PM6-Rotations- und Schwingungsparameter für den amb-metal-Komplex plus NTA-Produkte enthalten. Geben Sie Nein ein für:Ist einer der Phasenraumbegrenzungsübergänge oder PSL TS atomar? Geben Sie den Speicherort und den Namen der komplexen Datei amb-metal ein.
Verwenden Sie 1,062 für Skalierungsfrequenzen, drücken Sie die Eingabetaste für die Anzahl der Atome und geben Sie Nein für: Ist das Molekül linear? Wiederholen Sie dasselbe für die Modellierungsdatei, die die Schwingungs- und Rotationsfrequenzen des NTA-Produkts enthält. Geben Sie die Beschreibung des umkreisenden TS ein. Geben Sie 1,0 für die Ladung des AMB-Metallions ein und geben Sie dann die Polarisierbarkeit und das Dipolmoment von NTA ein.
Wählen Sie 0 Kelvin für die Rotationstemperatur und den gesperrten Dipol für die Behandlung des umkreisenden Übergangszustands. Geben Sie die durchschnittlichen Massen des amb-Metallions und NTA ein. Drücken Sie die Eingabetaste, um die 1-D- und 2-D-Rotationskonstanten aus den Modellierungsdateien zu lesen.
Wählen Sie 0 für behinderte Rotoren, 1 für Molekülsymmetrie und 1 für Reaktionsdegeneration. Geben Sie die Option Keine Änderungen ein. Wählen Sie für Produktkanal 2 1 für den einzelnen Übergangszustand, 0 für keinen für die sequenzielle Dissoziation und 1 für die Umkreisung für den Übergangszustandstyp aus.
Wählen Sie G, um Modellierungsdateien einzulesen, die die PM6-Rotations- und Schwingungsparameter für den NTA-Metallkomplex und die amb-Produkte enthalten. Geben Sie dann die Beschreibung des umkreisenden TS ein. Geben Sie 1,0 für die Ladung des NTA-Metallkomplexions ein und geben Sie die Polarisierbarkeit und das Dipolmoment des amb ein. Wählen Sie 0 Kelvin für die Rotationstemperatur und Locked-Dipole für die Behandlung des umkreisenden Übergangszustands.
Geben Sie die durchschnittlichen Massen des NTA-Metallkomplexes und der amb-Produkte ein. Drücken Sie die Eingabetaste, um die 1-D- und 2-D-Rotationskonstanten aus den Modellierungsdateien zu lesen. Wählen Sie 0 für behinderte Rotoren, 1 für Molekülsymmetrie und 1 für Reaktionsdegeneration.
Geben Sie dann Keine Änderungen ein. Um inaktive 2D-Rotationen zu verarbeiten, wählen Sie die Standardoptionen für die statistische Drehimpulsverteilung und integrieren Sie die Verteilung P-E, G über J. Verwenden Sie den Standardwert von 32 für die Anzahl der Punkte in der Integration.
Wählen Sie im Menü Modell die Option Parameter optimieren, um Daten anzupassen, und geben Sie die minimale Energie und die maximale Energie ein, um die Datenanpassung zu beginnen bzw. zu beenden. Wählen Sie 1 für die experimentellen Standardabweichungen der Gewichtungsmodelle. Wählen Sie basierend auf den Daten eine minimal akzeptable Standardabweichung von typischerweise 0,01 bis 0,001 aus.
Verwenden Sie den Standardwert für die E0-Konvergenzgrenze, und wählen Sie Nein, um einen beliebigen Parameter bei Barwert zu halten, 0,5 und 2,0 Elektronenvolt für die untere und obere Grenze und 2 für die abgeleitete Bewertungsmethode. Wählen Sie im Menü Optimierung die Option Optimierung beginnen. Das CRUNCH-Programm optimiert das ausgewählte TCID-Modell auf die experimentellen Daten.
Wählen Sie schließlich im Menü Modell delta-H und S bei T für die thermochemische Bewertung der beiden Dissoziationskanäle aus. Das repräsentative Bild zeigt die Primärstrukturen alternativer metallbindender A- und H-Peptide. Die Farbe hebt die potenziellen Metallbindungsstellen hervor.
Die Energieabhängigkeit für die Bildung der amb-Metall- und NTA-Metall-Produktionen ist hier dargestellt. Die Kollisionsenergie des Massenschwerpunkts, bei der eine 50%ige Dissoziation des ternären amb-Metall-NTA-Komplexes vorliegt, ist in den Graphen enthalten. Die repräsentativen Bilder zeigen das Dynamikmodell für die energieaufgelöste TCID-Methode.
Die Kollisionen zwischen dem ambH-Zink-NTA-Komplex plus Argon führen zur Dissoziation zum ambH-Zink-Komplex und freiem NTA oder NTA-Zink-Komplex und freien ambH-Produkten. Die Schwellenenergien E1 und E2 entsprechen den 0-Kelvin-Dissoziationsenthalpien für die Reaktionen ambH-Zink-NTA-Komplex zu ambH-Zink-Komplex und freiem NTA bzw. ambH-Zink-NTA-Komplex zu NTA-Zink-Komplex bzw. freiem ambH. Hier werden die PM6-geometrieoptimierten ternären amb-Metall-NTA-Komplexe von A und H gezeigt.
Diese Conformere wurden in der TCID-Modellierung der experimentellen Daten verwendet und aus anderen Kandidatenstrukturen ausgewählt, indem ihre elektronischen PM6-Energien und ihre berechneten Kollisionsquerschnitte mit den IM-MS-gemessenen Kollisionsquerschnitten verglichen wurden. Die energieaufgelöste TCID der vier amb-Metall-NTA-Komplexe ist in diesen Bildern dargestellt. Für die Spezies A und H sind hier die Produktionen von amb-Metall und NTA-Metall mit den gewundenen CRUNCH-Schwellenwerten dargestellt.
Die Energiewerte sind die Dissoziationsenthalpien bei 0 Kelvin für die Reaktionen amb-Metall-NTA zu amb-Metall und freiem NTA oder amb-metaL-NTA zu NTA-Metall und freiem amb. Ein Vergleich der freien Gibbs-Assoziationsenergien in Kilojoule pro Mol und der Bildungskonstanten, die aus den Dissoziationsenthalpien, Netto-Null-Kelvin, abgeleitet sind, mit statisch-mechanischen Berechnungen unter Verwendung der PM6-Parameter sind hier gezeigt. Die Reaktion von NTA-Nickel und freiem ambA zur Bildung des ambA-Nickel-NTA-Komplexes weist die höchste Bildungskonstante auf und stellt die Reaktion dar, bei der das ambA-markierte Protein durch das NTA-Nickel in der Affinitätssäule immobilisiert wird.
Die CRUNCH-Anpassung erfordert ein sorgfältiges Screening von Reaktanten und Produkten, um genaue Schwellenenergien zu erhalten. Kenntnisse in der molekularen Modellierung, um die Strukturen und zuverlässigen molekularen Parameter zu erhalten, sind erforderlich. Die hier beschriebenen Gesamtmethoden könnten entwickelt werden, um die Wirksamkeit von Molekülen zu überprüfen, die Metallkofaktoren und aktive Zentren von Proteinen binden sollen, um die enzymatischen Funktionen zu blockieren.
