Diese Methode wird einen besseren Einblick in die Funktion des parenchymalen arteriolaren Endothels geben, das den intrazerebralen Blutfluss direkt mit der Förderung der neuronalen und glialen Aktivität im gesamten Gehirn verbindet. Ein deutlicher technischer Vorteil gegenüber dem Arteriolendothel ist die verbesserte Auflösung der morphologischen Dimensionen und der Kalzium- und elektrischen Signalübertragung zwischen einzelnen intrazerebralen Endothelzellen und ihren jeweiligen Organellen. Zunächst wird die Isolierung und Untersuchung des intrazerebralen Endothels sehr schwierig sein.
Es ist jedoch möglich, diese Technik mit viel Übung zu meistern, begleitet von Geduld und Hingabe. Waschen Sie das isolierte Gehirn mit einer kalten Dissektionslösung in einem Becherglas oder einer Petrischale, um das restliche Blut von der Oberfläche des Gehirns zu entfernen. Legen Sie die ventrale Gehirnseite nach oben in eine Kammer, die kalte Dissektionslösung enthält, um parenchymale Arteriolen zu isolieren.
Um parenchymale Arteriolen zu isolieren, sichern Sie das isolierte Gehirn mit Stahlstiften in kalter Dissektionslösung in einer Petrischale, die mehr als 50 Zentimeter tiefe mit Holzkohle angereicherte Siliziumpolymerbeschichtung enthält. Schneiden Sie ein Rechteck aus Hirngewebe aus beiden Hemisphären mit einer scharfen und ausgerichteten Sezierschere um die MCA herum, während Sie sicherstellen, dass der obere Teil des Gewebesegments hinter dem Verzweigungspunkt vom Kreis von Willis liegt. Befestigen Sie das Hirngewebe in der Schale mit dem MCA nach oben mit Stahlstiften.
Machen Sie vorsichtig einen flachen Schnitt in der Nähe der Stifte und entfernen Sie die Pia mit einer kleinen Pinzette, die sich vorsichtig von einem Ende zum anderen schält. Sichern Sie vorsichtig die isolierte Pia mit parenchymalen Arteriolen, die von MCA verzweigt sind, in der Schale mit den Stiften und sezieren Sie vorsichtig die parenchymalen Arteriolen. Schneiden Sie alle verbleibenden distalen Äste ab und stellen Sie sicher, dass die Arteriole sauber ist und kein Gewebe anhaftet.
Verwenden Sie diese saubere, intakte Arteriole für die enzymatische Verdauung. Alternativ können Sie jede Arteriole für die enzymatische Verdauung in zwei Stücke schneiden, um auf Wunsch Endothelröhren vorzubereiten. Für die partielle Verdauung von Arteriolsegmenten legen Sie intakte Arteriolsegmente in einen Milliliter Dissoziationslösung in einem 10-Milliliter-Glasröhrchen, das Papain, Dithioerythrit, Kollagenase und Elastase enthält.
Inkubieren Sie Arteriolsegmente bei 34 Grad Celsius für 10 bis 12 Minuten. Um den arteriolaren Endothelschlauch zu isolieren, legen Sie die mit dem Mikrospritzeninjektor befestigte Verreibungspipette in die Dissoziationslösung in der Kammer und positionieren Sie sie nahe an einem Ende des verdauten Gefäßsegments. Stellen Sie eine Rate im Bereich von ein bis drei Nanolitern pro Sekunde auf dem Pumpenregler für eine schonende Verreibung ein.
Unter Beibehaltung einer 100-fachen bis 200-fachen Vergrößerung ziehen Sie das Arteriolärsegment in die Pipette zurück und injizieren Sie dann, um die Adventitia- und glatten Muskelzellen zu dissoziieren. Trituieren Sie das Gefäßsegment, bis alle glatten Muskelzellen dissoziiert sind und nur noch Endothelzellen als intaktes Rohr übrig bleiben. Mit Mikromanipulatoren befestigen Sie jedes Ende des Endothelrohrs auf dem Glasdeckel in der Kammer mit Borosilikatglas-Pinning-Pipetten Um das Endothelmembranpotential zu messen, positionieren Sie beim Betrachten durch das 4X-Objektiv vorsichtig die scharfe Elektrodenspitze knapp über einer Zelle des arteriolaren Endothelrohrs in die fließende physiologische Salzlösung mit einem Mikromanipulator.
Erhöhen Sie die Vergrößerung schrittweise auf das 400-fache und positionieren Sie die Elektrodenspitze nach Bedarf neu. Führen Sie mit dem Mikromanipulator vorsichtig die Spitze einer scharfen Elektrode in eine der Zellen des Endothelrohrs ein und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der VM mit einem Elektrometer. Sobald die endotheliale ruhende VM von minus 30 bis minus 40 Millivolt stabil ist, wenden Sie die gewünschten pharmakologischen Wirkstoffe pro Versuchsziel an.
Laden Sie das Endothelrohr mit dem Fluoreszenz-Tracker für die Plasmamembran oder die gewünschte Organelle bei 37 Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten. Waschen Sie die Zellen mit frischer physiologischer Superfusionssalzlösung und bilden Sie lebende Zellen unter dem Mikroskop bei der Anregungswellenlänge der jeweiligen Farbstoffe ab. Die Endothelfunktion wurde durch Messung des intrazellulären Kalzium- und Membranpotentials als Reaktion auf einen pharmakologischen Wirkstoff MTA, einen potenten purinergen Rezeptoragonisten bei 37 Grad Celsius, beurteilt.
Bei Anwendung eines mikromolaren MTA steigt die intrazelluläre Calciumkonzentration bei gleichzeitiger Hyperpolarisation schnell an. Darüber hinaus wurde das intakte Endothel bei 37 Grad Celsius mit fluoreszierenden Trackern zur Visualisierung zur Untersuchung der Zellmorphologie inkubiert. Live-Endothelzellbildgebung zeigte eine Co-Färbung für Plasmamembran und Kerne.
Die Plasmamembran wurde zusammen mit einer endoplasmatischen Retikulumfluoreszenzfärbung gefärbt, wodurch Bereiche mit scheinbarer Überlappung der Notaufnahme in der Nähe der Plasmamembran orange erscheinen. Der Experimentator sollte während der Dissektion und Isolierung vorsichtig sein, um Schäden an den Arteriolen zu vermeiden, da eine beschädigte Arteriole definitiv keinen intakten Endothelschlauch ergibt. Nach dem Verfahren können die Zellen für die fixierte Immunhistochemie mit fluoreszierenden Antikörpern oder für die Färbung lebender Zellen von Organellen und Membranlipiden verwendet werden.
Diese Technik wird neue Informationen zum Verständnis der Mechanismen generieren, die dem zerebralen Blutfluss auf der grundlegenden Ebene für die Physiologie zugrunde liegen, und Übergänge in Richtung Pathologie für die Therapie auswählen.
