ستوفر هذه الطريقة نظرة أفضل على وظيفة بطانة الشرايين المتنية التي تربط مباشرة تدفق الدم داخل المخ بتغذية النشاط العصبي والدبقي في جميع أنحاء الدماغ. ميزة تقنية متميزة على بطانة الشرايين هي الدقة المحسنة للأبعاد المورفولوجية والكالسيوم والإشارات الكهربائية بين الخلايا البطانية الفردية داخل المخ والعضيات الخاصة بها. في البداية ، سيكون عزل وفحص البطانة داخل المخ تحديا كبيرا.
ومع ذلك ، من الممكن إتقان هذه التقنية مع الكثير من الممارسة مصحوبة بالصبر والتفاني. اغسل الدماغ المعزول بمحلول تشريح بارد في كوب أو طبق بتري لإزالة الدم المتبقي من سطح الدماغ. ضع جانب الدماغ البطني متجها لأعلى في غرفة تحتوي على محلول تشريح بارد لعزل الشرايين المتني.
لعزل الشرايين المتني، قم بتأمين الدماغ المعزول بدبابيس فولاذية في محلول تشريح بارد في طبق بتري يحتوي على طلاء بوليمر السيليكون المشبع بالفحم بعمق أكثر من 50 سم. قم بقص مستطيل من أنسجة المخ من نصفي الكرة الأرضية باستخدام مقص تشريح حاد ومحاذاة حول MCA مع التأكد من أن الجزء العلوي من جزء الأنسجة يتجاوز نقطة التفرع من دائرة ويليس. قم بتأمين أنسجة المخ في الطبق مع توجيه MCA لأعلى باستخدام دبابيس فولاذية.
قم بعمل شق ضحل بعناية بالقرب من المسامير وقم بإزالة pia بملقط صغير ، مع تقشير بلطف من أحد الطرفين نحو الطرف الآخر. قم بتأمين pia المعزولة بعناية مع الشرايين المتنية المتفرعة من MCA في الطبق مع المسامير وتشريح الشرايين المتنية بعناية. اقطع أي فروع بعيدة متبقية وتأكد من نظافة الشرايين بدون أي أنسجة متصلة.
استخدم هذا الشريان السليم النظيف للهضم الإنزيمي. بدلا من ذلك ، قم بقطع كل شريان إلى قطعتين للهضم الأنزيمي لإعداد أنابيب بطانية إذا رغبت في ذلك. للهضم الجزئي للشرائح الشريانية ، ضع شرائح الشرايين السليمة في ملليلتر واحد من محلول التفكك في أنبوب زجاجي سعة 10 ملليلتر يحتوي على غراء وثنائي ثيوريثريتول وكولاجيناز وإيلاستيز.
احتضان شرائح الشرايين عند 34 درجة مئوية لمدة 10 إلى 12 دقيقة. لعزل الأنبوب البطاني الشرياني ، ضع ماصة التريتوريشن المرفقة بحاقن المحقنة الدقيقة في محلول التفكك في الغرفة وضعها بالقرب من أحد طرفي جزء الوعاء المهضوم. اضبط معدلا ضمن نطاق واحد إلى ثلاثة نانولتر في الثانية على وحدة التحكم في المضخة لإجراء عملية سحب لطيفة.
مع الحفاظ على تكبير 100X إلى 200X ، اسحب الجزء الشرياني إلى الماصة ثم حقن لفصل Adventitia وخلايا العضلات الملساء. قم بتقسيم جزء الوعاء إلى ثلاثة أضعاف حتى يتم فصل جميع خلايا العضلات الملساء وتبقى الخلايا البطانية فقط كأنبوب سليم. باستخدام المتلاعبين الدقيقين ، قم بتأمين كل طرف من الأنبوب البطاني على الغطاء الزجاجي في الغرفة باستخدام ماصات تثبيت زجاجية من البورسليكات لقياس إمكانات الغشاء البطاني ، أثناء المشاهدة من خلال هدف 4X ، ضع بعناية طرف القطب الحاد فوق خلية من الأنبوب البطاني الشرياني في محلول الملح الفسيولوجي المتدفق باستخدام متلاعب صغير.
قم بزيادة التكبير تدريجيا إلى 400X وقم بتغيير موضع طرف القطب حسب الحاجة. باستخدام المتلاعب الدقيق ، أدخل بلطف طرف قطب كهربائي حاد في إحدى خلايا الأنبوب البطاني وابدأ في تسجيل VM باستخدام مقياس كهربائي. بمجرد أن يكون VM المستقر للراحة البطانية من ناقص 30 إلى ناقص 40 مللي فولت ، قم بتطبيق العوامل الدوائية المطلوبة لكل هدف تجريبي.
قم بتحميل الأنبوب البطاني باستخدام متعقب التألق لغشاء البلازما أو العضية المطلوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة. اغسل الخلايا بمحلول ملح فسيولوجي فائق الانصهار الطازج وصور الخلايا الحية تحت المجهر عند الطول الموجي المثير للأصباغ المعنية. تم تقييم الوظيفة البطانية عن طريق قياس الكالسيوم داخل الخلايا وإمكانات الغشاء استجابة للعامل الدوائي MTA ، وهو ناهض مستقبلات بيورينية قوي عند 37 درجة مئوية.
عند تطبيق MTA ميكرومولار واحد ، يزداد تركيز الكالسيوم داخل الخلايا بسرعة مع فرط الاستقطاب المصاحب. علاوة على ذلك ، تم احتضان البطانة السليمة عند 37 درجة مئوية مع أجهزة تتبع الفلورسنت للتصور لفحص المورفولوجيا الخلوية. أظهر تصوير الخلايا البطانية الحية تلطيخا مشتركا لغشاء البلازما والنواة.
تم تلطيخ غشاء البلازما مع بقعة فلورسنت شبكية إندوبلازمية حيث تظهر مناطق التداخل الواضح للطوارئ بالقرب من غشاء البلازما باللون البرتقالي. يجب أن يكون المجرب حذرا أثناء التشريح والعزل لتجنب تلف الشرايين لأن الشرايين التالفة لن تسفر بالتأكيد عن أنبوب بطاني سليم. بعد الإجراء ، يمكن استخدام الخلايا للكيمياء النسيجية المناعية الثابتة مع الأجسام المضادة الفلورية أو تلطيخ الخلايا الحية للعضيات والدهون الغشائية.
ستولد هذه التقنية معلومات جديدة لفهم الآليات الكامنة وراء تدفق الدم الدماغي على المستوى الأساسي لعلم وظائف الأعضاء وتحديد التحولات نحو علم الأمراض للعلاج.
