In einem Blutgefäß ist die Anzahl der Endothelzellen sehr gering, was es schwierig macht, sie zu untersuchen. Unser Protokoll beseitigt diese Einschränkung und ermöglicht es uns, neuartige molekulare Wege und Therapeutika zu untersuchen. Unser Protokoll ermöglicht es uns, endothelial angereicherte Proben zu erhalten und zu untersuchen, wie akute und chronische Flussstörungen diesen Zelltyp beeinflussen.
Die Fähigkeit, Endothelzellen genauer zu untersuchen, ermöglicht es, Zielgene und damit potenzielle Therapeutika für Atherosklerose zu definieren, die auf Endothelzellen abzielen. Die Isolierung der Halsschlagader ist schwierig und erfordert Geduld und Erfahrung. Um zu beginnen, bereiten Sie das Tier vor, indem Sie 0,05 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin subkutan injizieren.
Sterilisieren Sie den epilierten Bereich dreimal mit Betadine und Isopropanollösung. Machen Sie einen ventralen Mittellinienschnitt von etwa einem Zentimeter im Halsbereich. Belichten Sie dann den LCA-Zweigpunkt durch stumpfe Dissektion.
Ligieren Sie die linke innere Halsschlagader, die äußere Halsschlagader und die Hinterhauptsarterien mit 6-0 Nähten, wobei die obere Schilddrüsenarterie unberührt bleibt. Verschließen Sie den Schnitt mit Gewebekleber oder Nähten. Bringen Sie die Maus in einen vorgewärmten Erholungskäfig, der bei 37 Grad Celsius gehalten wird.
Legen Sie die Maus bis zu einer Stunde lang auf ein sauberes Handtuch, um eine Unterkühlung nach der Operation zu vermeiden. Führen Sie eine 21-Gauge-Nadel in die IV-Linie ein, die durch die Herzspitze mit dem linken Ventrikel verbunden ist. Lassen Sie die retrograde Perfusion für zwei bis drei Minuten mit normaler Kochsalzlösung bei Raumtemperatur zu.
Halten Sie eine konstante Durchflussrate aufrecht, indem Sie während der Injektion oder Verwendung einer IV-Leitung einen gleichmäßigen Druck ausüben und den Kochsalzbeutel in einer Höhe von acht bis neun Fuß halten. Entfernen Sie die Haut aus der Halsregion mit allem Fett, Muskeln und Bindegewebe, um die Halsschlagadern freizulegen. Entfernen Sie dann das periadventitiale Gewebe um die Halsschlagader herum, so dass die Halsschlagader am Körper befestigt bleibt.
Machen Sie einen Schnitt unterhalb der Ligaturstelle in der LCA, um die Durchblutung zu ermöglichen. Durchbluten Sie die LCA durch den linken Ventrikel für eine weitere Minute, um Blutspuren zu entfernen. Waschen Sie die Außenseite der Halsschlagadern mit normaler Kochsalzlösung, um Blutspuren zu entfernen.
Verwenden Sie eine Insulinspritze mit einer 29-Gauge-Nadel, um 50 Mikroliter Verdauungspuffer in das Lumen des distalen Endes der linken Halsschlagader zu injizieren. Verwenden Sie einen Mikroclip, um das proximale Ende der Halsschlagader mit Verdauungspuffer gefüllt zu klemmen. Fügen Sie 15 bis 20 Mikroliter Verdauungspuffer in das Lumen hinzu und schneiden Sie das distale Ende ab, um eine Freisetzung von Verdauungspuffer zu vermeiden.
Übertragen Sie die Halsschlagadern von der Maus in 35-Millimeter-Schalen mit warmer 37 Grad Celsius HEPES-gepufferter Kochsalzlösung. Und brütet sie für 45 Minuten bei 37 Grad Celsius mit intermittierendem Schaukeln. Entfernen Sie die Halsschlagader mit den Klemmen aus der 35-Millimeter-Schale, nachdem die luminale enzymatische Verdauung abgeschlossen ist.
Lösen Sie die Klemmen vorsichtig, damit der Verdauungspuffer nicht ausläuft. Halten Sie ein Ende der Halsschlagader auf ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie dem Lumen 100 Mikroliter warmen Verdauungspuffer hinzu, indem Sie eine 29-Gauge-Nadel einführen, die mit einer Insulinspritze ausgestattet ist.
Spülen Sie schnell das Lumen der Halsschlagader in der Mikrozentrifugenröhre und fügen Sie dann 0,3 Mikroliter FBS in das Röhrchen hinzu, um die Reaktion zu stoppen. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius mit einer Zentrifuge mit einem Rotor mit festem Winkel und verwerfen Sie den Überstand.
Suspendieren Sie die Zellen im Verdauungspuffer, der ein Zelldissoziationsreagenz enthält, und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um sie in einzelne Zellen zu trennen. Blockieren Sie die enzymatische Reaktion, indem Sie 0,15 Milliliter FBS in das 0,5-Milliliter-Röhrchen geben und die Zentrifugation wiederholen. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern eiskalter 1% BSA-Lösung in PBS in einem 0,2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.
Für die Einzelzellanalyse resuspendieren Sie das Pellet mit 100 Mikrolitern eiskaltem 1% BSA in PBS in einem 0,2-Milliliter-Röhrchen. Für die Einzelkernanalyse resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikrolitern 0,04% BSA in eiskaltem PBS und zentrifugieren Sie die Einzelzellsuspension bei 500 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Die Einzelzellsuspension mit eiskaltem Lysepuffer zersetzen und fünf Minuten auf Eis inkubieren.
Mischen Sie das Lysat mit einer P20-Pipette und inkubieren Sie weitere 10 Minuten. Anschließend wird das Lysat in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Waschen Sie die Ly-Zellen mit 500 Mikrolitern Puffer und mischen Sie sie mit einer Pipette.
Wiederholen Sie dann die Zentrifugation. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Kernpellet in 150 Mikrolitern des verdünnten Kernpuffers. Zählen Sie die Einzelkernpräparate mit einem Hämozytometer.
Im Anschluss an die Einzelkernsequenzierungsstudie wurden Einzelzell- und Einzelkerne erhalten und mittels Hellfeld- und Phasenkontrastmikroskopie visualisiert. Die Wirksamkeit der Einzelkernpräparation aus der Einzelzellsuspension wurde ebenfalls nachgewiesen. Nach der Einzelzell-RNA-Sequenzierungsstudie wurden verschiedene Parameter wie die Verteilung von Genen pro Zelle, eindeutiger molekularer Identifikator pro Zelle, mitochondriale Messwerte pro Zelle und Sequenzierungssättigungsdaten erhalten.
Für die Einzelzell-ATAC-Sequenzstudie wurde die Insertgrößenverteilung einschließlich des Nukleosomenbandenmusters beobachtet. Der normalisierte TSS-Anreicherungswert wurde ebenfalls beobachtet. Darüber hinaus liest das prozentuale Fragment in den Spitzenwerten.
Die Fragmente der Spitzenregion, der TSS-Anreicherungswert, das Verhältnis der Lesevorgänge in den genomischen Stellen der Blacklist und das Nukleosomensignalverhältnis wurden bestimmt. Der enzymatische Aufschluss ist eine Belastung für die Zellen, daher ist es wichtig, die Proben auf Eis zu halten und das Verfahren so schnell wie möglich durchzuführen. Wir können diese Methode verwenden, um Endothelzellen aus Mäusen zu gewinnen und zu platten.
Wir können diese Technik auch verwenden, um Omix-basierte Massenstudien durchzuführen. Diese Technik ebnete den Weg, um die Wirkung eines gestörten Blutflusses auf Endothelzellen in vivo in einer einzigen Zellweise zu untersuchen.
