Bu yöntem, intraserebral kan akışını beyindeki nöronal ve glial aktivitenin körüklenmesine doğrudan bağlayan parankimal arteriyolar endotelin işlevi hakkında daha iyi bir fikir verecektir. Arteriol endotel üzerinde belirgin bir teknik avantaj, bireysel intraserebral endotel hücreleri ve bunların ilgili organelleri arasında morfolojik boyutların ve kalsiyum ve elektrik sinyalizasyonunun artmış çözünürlüğüdür. Başlangıçta, intraserebral endotelin izolasyonu ve muayenesi çok zor olacaktır.
Bununla birlikte, bu tekniğe sabır ve özveri eşliğinde bol miktarda uygulama ile hakim olmak mümkündür. Beynin yüzeyinden kalan kanı çıkarmak için izole edilmiş beyni bir beher veya Petri kabında soğuk bir diseksiyon çözeltisi ile yıkayın. Parankimal arteriolleri izole etmek için ventral beyin tarafını yukarı bakacak şekilde soğuk diseksiyon çözeltisi içeren bir odaya yerleştirin.
Parankimal arteriolleri izole etmek için, izole edilmiş beyni, 50 santimetreden daha derin odun kömürü infüzyonlu silikon polimer kaplama içeren bir Petri kabında soğuk diseksiyon çözeltisinde çelik pimlerle sabitleyin. MCA'nın etrafındaki keskin ve hizalanmış diseksiyon makaslarıyla her iki yarımküreden bir beyin dokusu dikdörtgenini kesin, doku segmentinin üst kısmının Willis çemberinden dallanma noktasını geçmesini sağlayın. MCA çelik pimlerle yukarı bakacak şekilde beyin dokusunu kabın içine sabitleyin.
Pimlerin yakınında sığ bir kesi dikkatlice yapın ve piayı küçük forsepslerle çıkarın, bir uçtan diğerine doğru hafifçe soyun. İzole edilmiş piayı, çanaktaki MCA'dan dallanmış parankimal arteriollerle pimlerle dikkatlice sabitleyin ve parankimal arteriolleri dikkatlice diseke edin. Kalan distal dalları kesin ve arteriolün doku takılmadan temiz olduğundan emin olun.
Enzimatik sindirim için bu temiz bozulmamış arteriol kullanın. Alternatif olarak, istenirse endotel tüpleri hazırlamak için enzimatik sindirim için her arteriol iki parçaya bölün. Arteriyolar segmentlerin kısmi sindirimi için, bozulmamış arteriyolar segmentleri papain, ditiyoeritritol, kollajenaz ve elastaz içeren 10 mililitrelik bir cam tüp içinde bir mililitre ayrışma çözeltisine yerleştirin.
Arteriyolar segmentleri 10 ila 12 dakika boyunca 34 santigrat derecede inkübe edin. Arteriyolar endotel tüpünü izole etmek için, mikro şırınga enjektörüne bağlı tritürasyon pipetini odadaki ayrışma çözeltisine yerleştirin ve sindirilmiş damar segmentinin bir ucuna yakın bir yere yerleştirin. Nazik tritürasyon için pompa kontrolöründe saniyede bir ila üç nanolitre aralığında bir hız ayarlayın.
100X ila 200X büyütmeyi korurken, arteriyolar segmenti pipete çekin ve daha sonra adventiti ve düz kas hücrelerini ayırmak için enjekte edin. Tüm düz kas hücreleri ayrışana ve sadece endotel hücreleri sağlam bir tüp olarak kalana kadar damar segmentini tritüre edin. Mikro manipülatörlerle, odadaki cam kapaklar üzerindeki endotel tüpünün her bir ucunu borosilikat cam iğneleme pipetleri ile sabitleyin Endotel zarı potansiyelini ölçmek için, 4X hedefini incelerken, keskin elektrot ucunu arteriyolar endotel tüpünün bir hücresinin hemen üzerine dikkatlice yerleştirin.
Büyütmeyi kademeli olarak 400X'e yükseltin ve elektrot ucunu gerektiği gibi yeniden konumlandırın. Mikro manipülatörü kullanarak, keskin bir elektrotun ucunu endotel tüpünün hücrelerinden birine yavaşça yerleştirin ve bir elektrometre kullanarak VM kaydetmeye başlayın. Endotel istirahat VM'si eksi 30 ila eksi 40 milivolt arasında stabil hale geldiğinde, deneysel amaç başına istenen farmakolojik ajanları uygulayın.
Endotel tüpünü, plazma zarı veya istenen organel için floresan izleyici ile 15 ila 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede yükleyin. Hücreleri taze süperfüzyon fizyolojik tuz çözeltisi ile yıkayın ve canlı hücreleri mikroskop altında ilgili boyaların uyarma dalga boyunda görüntüleyin. Endotel fonksiyonu, 37 santigrat derecede güçlü bir pürinerjik reseptör agonisti olan farmakolojik ajan MTA'ya yanıt olarak hücre içi kalsiyum ve membran potansiyeli ölçülerek değerlendirildi.
Bir mikromolar MTA'nın uygulanması üzerine, hücre içi kalsiyum konsantrasyonu, eşlik eden bir hiperpolarizasyon ile hızla artar. Ayrıca, bozulmamış endotel, hücresel morfolojiyi incelemek için görselleştirme için floresan izleyicilerle 37 santigrat derecede inkübe edildi. Canlı endotel hücre görüntülemesinde plazma membranı ve çekirdekleri için ko-boyanma görüldü.
Plazma zarı, endoplazmik retikulum floresan boyası ile birlikte boyandı ve bu sayede plazma zarının yakınında ER'nin görünür örtüşme alanları turuncu göründü. Deneyci, arteriollerin zarar görmesini önlemek için diseksiyon ve izolasyon sırasında dikkatli olmalıdır, çünkü hasarlı bir arteriol kesinlikle sağlam bir endotel tüpü vermeyecektir. İşlemi takiben, hücreler floresan antikorları ile sabit immünohistokimya veya organellerin ve membran lipitlerinin canlı hücre boyaması için kullanılabilir.
Bu teknik, fizyoloji için temel düzeyde serebral kan akışının altında yatan mekanizmaları anlamak ve tedavi için patolojiye geçişleri seçmek için yeni bilgiler üretecektir.
