Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es nicht nur Ansätze zur Reinigung von Vesikeln aus Kultur auf verschiedenen Skalen, Kompromisse, Unterschiede zwischen den Methoden und auch die Berücksichtigung der Arbeit mit Feldproben demonstriert. Cyanobakterien stellen einzigartige Herausforderungen bei der Probenahme und Analyse von Vesikeln dar. Diese Techniken haben erfolgreich Vesikel aus Kultur und aus Umweltproben isoliert und konzentriert.
Um Proben von weniger als 500 Millilitern zu konzentrieren, beginnen Sie mit dem Spülen der 15 bis 20 Milliliter Ultrafiltrationszentrifugalkonzentratoren mit Reinstwasser Typ 1. Laden Sie die Konzentratoren in die Zentrifuge und drehen Sie sie bei 4.400 x g bei vier Grad Celsius. Verwerfen Sie den Durchlauf und wiederholen Sie den Schritt mindestens zweimal.
Laden Sie die überstehende Probe in einen mit Wasser gespülten Konzentrator und drehen Sie sie unter den gleichen Bedingungen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Probe auf ein endgültiges Volumen von 15 bis 30 Millilitern konzentriert ist. Um ein Volumen von mehr als 500 Millilitern zu konzentrieren, führen Sie eine tangentiale Strömungsfiltration durch, indem Sie die Vorrichtung wie im Manuskript beschrieben einrichten.
Befestigen Sie eine Peristaltikpumpe an der Ansaugleitung und platzieren Sie verstellbare Klemmen an der Retentatorleitung. Desinfizieren Sie die tangentiale Strömungsfiltration, wie im Manuskript beschrieben, und spülen Sie das Gerät dann mit einem Liter Reinstwasser Typ 1. Weniger als 0,2 Mikron Filtrat in das Probenreservoir geben.
Erhöhen Sie langsam die Pumpendrehzahl und den Gegendruck an der Retentatleitung, um die Leistung der Filtratleitungen zu erhöhen. Fahren Sie mit der tangentialen Strömungsfiltration fort und füllen Sie das Reservoir mit Kulturüberständen auf, während das Material entfernt wird. Stoppen Sie die Konzentration der Probe, sobald das Volumen im Reservoir die geringstmögliche Menge erreicht hat, die erforderlich ist, um den Durchfluss in die Ansaugleitung aufrechtzuerhalten, ohne Luftblasen einzuführen.
Schließen Sie die Abflussleitung mit einer Klemme. Entfernen Sie den Gegendruck auf der Retentionslinie. Rezirkulieren Sie den konzentrierten Überstand für 10 Minuten durch den Filter und reduzieren Sie die Rezirkulationsrate von 20 auf 40 Milliliter pro Minute, um die Rückgewinnung zu maximieren.
Bewegen Sie die Retentatlinie in ein sauberes Gefäß, entfernen Sie die Ansaugleitung aus der Probe und sammeln Sie das konzentrierte Material. Das verbleibende Material im Probenbehälter wird mit einer Pipette zurückgewonnen. Filtern Sie den konzentrierten Überstand durch einen 0,2 μm Spritzenfilter.
Lagern Sie das Endkonzentrat bei Bedarf etwa drei Wochen lang bei vier Grad Celsius, bevor Sie zur Vesikelreinigung übergehen. Um die konzentrierte Kulturprobe zu pelletieren, legen Sie sie in ein sauberes Ultrazentrifugenröhrchen und fügen Sie sauberes Medium oder Puffer hinzu, um sicherzustellen, dass das Röhrchen gefüllt ist. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand mit einer Pipette.
Waschen Sie das pelletierte Material mit frischen Nährmedien oder Waschpuffer, wie z.B. 1X phosphatgepufferte Kochsalzlösung und wiederholen Sie die Zentrifugation. Resuspendiert das endgültige Pellet in frischer Kultur durch schonendes Pipettieren mit einer Ein-Milliliter-Pipette und gibt es in ein sauberes Gefäß. Um eine Dichtegradienten-Ultrazentrifugation durchzuführen, bereiten Sie Iodixanol-Bestände wie im Manuskript beschrieben vor.
Mischen Sie einen Teil des 4X-Puffers mit drei Teilen von 60% iodixanol-Material, um eine 45% -iodixanol-Lösung herzustellen. Verdünnen Sie 45% Iodixanol mit 1X Puffer, um Vorräte an Gradientenmedien von 40, 35, 30, 25, 20, 15 und 10% Endiodixanol-Konzentrationen zu erhalten. Überlagern Sie dann vorsichtig gleiche Mengen all dieser Iodixanol-Gradientenmaterialien in ein Ultrazentrifugenröhrchen, wobei das gesamte Röhrchenvolumen genutzt wird.
Nach der Zentrifugation werden die Fraktionen von jeweils 0,5 Millilitern für einen Gradienten von etwa 4,5 Millilitern durch sorgfältiges Pipettieren oder Verwenden eines Fraktionssammlers gesammelt. Bestimmen Sie die Dichte jeder Fraktion in Gramm pro Milliliter mit einer Analysenwaage und einer kalibrierten Pipette. Entfernen Sie die Probe aus dem Röhrchen, bestimmen Sie das Gewicht und bringen Sie die Probe zurück in das Röhrchen.
Verdünnen Sie einzelne Fraktionen mit sauberem Puffer in einem neuen Röhrchen, gefolgt von einer sauberen Medien- oder Pufferwäsche. Tragen Sie vorsichtig fünf Mikroliter Vesikel auf und lassen Sie es fünf Minuten einwirken. Entfernen Sie die Probe, indem Sie den Rand eines Gitters mit einem Stück sauberem Filterpapier berühren.
Pippen Sie 20 bis 50 Mikroliter 2% Uranylacetat auf eine flache Oberfläche, die mit Kunststofffolie bedeckt ist. Legen Sie dann das Gitter zwei Minuten lang schwebend darauf. Entfernen Sie Uranylacetat mit Filterpapier und lassen Sie es kurz auf einem Tropfen Reinstwasser schwimmen, um es zu waschen.
Füllen Sie die Kammer mit Reinstwasser mit einer sauberen Spritze und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen entstehen. Klicken Sie auf "Kamera starten" und visualisieren Sie den optimalen Bereich der Kammer um den Daumenabdruck. Schieben Sie die Schieberegler für Bildschirmverstärkung und Kameraebene in Richtung Maximum und verringern Sie sie dann auf die niedrigste Stufe, um die dunkelsten Partikel zu sehen.
Passen Sie den Fokus nach Bedarf an, um sicherzustellen, dass die Partikel im gesamten Sichtfeld ungefähr gleich sichtbar sind, und waschen Sie weiter mit ultrasauberem Wasser, bis die Kammer sauber ist. Geben Sie die Vesikelprobe mit einer Ein-Milliliter-Spritze in die Kammer und bestätigen Sie die Aufnahmeeinstellungen. Wählen Sie "Standardmessung" aus der Dropdown-Box SOP und ändern Sie die Einstellungen, um mindestens drei technische Replikate von jeweils 60-Sekunden-Videos zu sammeln.
Drücken Sie create'and run script' und folgen Sie den Anweisungen und drücken Sie ungefähr 100 Mikroliter Probe in die Kammer zwischen den Replikaten. Bestimmen Sie die Partikelparameter, indem Sie auf Analyse klicken, das Experiment öffnen und die Beispieldatei laden. Wählen Sie "Ausgewählte Dateien verarbeiten" und warten Sie, bis die Analyse abgeschlossen ist.
Die Isolierung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC6803 zeigte, dass die äußere Membran Carotinoide enthält, die den durch direkte Pelletierung durch Ultrazentrifugation entnommenen Vesikelproben eine charakteristische orange Färbung verleihen. Das resuspendierte Vesikelpellet wurde mittels Transmissionselektronenmikroskopie entweder durch negative Färbung von Proben mit Uranylacetat oder durch Beobachtung ultradünner Schnitte untersucht.
Die Vesikelgrößenverteilung und -konzentration wurden mit Hilfe von dynamischer Lichtstreuung und Nanopartikel-Tracking-Analysen bewertet. Gereinigte Synechocystis sp. PCC6803 Vesikel wurden auf einem Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid Gel getrennt und auf Lipopolysaccharide gefärbt.
Proben sollten vor und nach der konzentrierten Vesikelprobe entnommen werden, um sicherzustellen, dass die tangentiale Strömungsfiltration funktioniert und sich die Vesikel konzentrieren. Dann müssen Sie beide Proben mit der Nanopartikel-Tracking-Analyse messen. Zukünftige Anstrengungen sind erforderlich, um diese Methode mit anderen Ansätzen wie der Größenausschlusschromatographie oder der asymmetrischen Feldflussfraktionierung zu kombinieren, um die Unterscheidung und Isolierung kleiner Partikel aus Kultur- und Umweltproben zu verbessern.
Diese Technik ist hilfreich, um die Cyanobakterienvesikel und die spezifischen funktionellen Rollen dieser Vesikel in der Cyanobakterienbiologie zu untersuchen.
