Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Hornhautentzündungen und ihrem Beitrag zur Wundheilung unter normalen und pathologischen Bedingungen ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine präzise und reproduzierbare Epithelwunde erzeugt, ohne die Basalmembran zu durchbrechen. Dieses Modell der Hornhautverwundung ist unkompliziert und schnell durchzuführen.
Das Verfahren wird Prinz Akowuah, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Bereiten Sie zunächst eine 1% -Fluoresceinlösung vor, indem Sie 10 Milligramm Natriumfluoresceinsalz in einem Milliliter steriler Kochsalzlösung oder PBS auflösen. Als nächstes bereiten Sie für die Anästhesie 10 Milliliter eines Ketamin-Xylazin-Cocktails vor, indem Sie zwei Milliliter Ketamin, einen Milliliter Xylazin und sieben Milliliter steriles PBS mischen.
Nachdem Sie eine 8 bis 12 Wochen alte C57 Black 6 Wildtyp-Maus betäubt haben, bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Pedalreflex nach dem Einklemmen der Zehen beurteilen. Um die Epithelhornhautwunde zu erzeugen, legen Sie die betäubte Maus unter ein Dissektionsmikroskop. Wunden Sie nur das rechte oder linke Auge und halten Sie die Konsistenz mit dem Auge aufrecht, das verwundet wird, wenn Sie sich von Maus zu Maus bewegen.
Halten Sie das Auge weit offen, indem Sie die Augenlider mit Daumen und Zeigefinger halten. Markieren Sie dann mit einem sterilen Trephin mit einem Durchmesser von zwei Millimetern das Zentrum der Hornhaut und drehen Sie das Trephin vorsichtig, um einen Eindruck auf das Hornhautepithel zu machen. Üben Sie keinen übermäßigen Druck aus, da dies zu einer Perforation der Hornhaut führen kann.
Als nächstes halten Sie den sterilen stumpfen Golfschläger-Spud in einem Winkel von etwa 45 Grad von der Hornhautoberfläche und debriden Sie das Epithel durch sorgfältiges und kontinuierliches Kratzen innerhalb des abgegrenzten Bereichs mit dem Spud. Wenden Sie keine übermäßige Kraft an und halten Sie die Hydratation bei Bedarf mit sterilem PBS aufrecht. Zur Überwachung des Wundverschlusses und der Re-Epithelisierung pipettieren Sie 1 bis 1,5 Mikroliter 1%fluorescein-Lösung auf die verletzte Oberfläche und bilden die Hornhaut mit einem Digitalmikroskop mit einer blauen Lichtquelle ab.
Stellen Sie sich die verwundete Hornhaut zu bestimmten Zeiten nach der Verwundung vor. Machen Sie Bilder innerhalb der ersten Minute nach der Zugabe von Fluoresceinlösung, um eine Ausbreitung der Lösung auf das umgebende Epithel zu vermeiden, was zu einer Überschätzung der Wundgröße führen kann. Als nächstes verfolgen Sie mit einer Bildanalysesoftware den Wundbereich und drücken den Wundbereich zu jedem Zeitpunkt als Prozentsatz der ursprünglichen Wundfläche zur Nullstunde aus.
Eine transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme der Hornhautwunde zeigt, dass die Epithel-Basalmembran auch nach der Verletzung intakt bleibt. Bei 8 bis 12 Wochen alten Wildtyp-Mäusen ist der Wundverschluss 24 Stunden nach der Verwundung abgeschlossen. Die Entzündungsreaktion auf Wunden ist durch Zellbildgebung am Limbus gekennzeichnet.
Hier ist das limbale Gefäßsystem einer unverwundeten Hornhaut mit extravaskulären Neutrophilen und das einer verwundeten Hornhaut mit extravaskulären Blutplättchen und Neutrophilen 30 Stunden nach dem Abrieb gezeigt. Um dieses Protokoll erfolgreich zu reproduzieren, muss in jedem Mausbereich die gleiche Dehnung verwendet werden, und die Wundgröße und -tiefe muss wie beschrieben erzeugt werden.
