We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.

Ethik-Erklärung: Die in dieser Studie verwendeten Augen wurden nach der Erklärung über die Offenheit für Tierforschung verwendet: 1. Herstellung von PLGA Biologisch abbaubare Membranen Ausgestattet mit Mikrotaschen <ol><li> Die Ring Gerüste wurden durch eine Kombination von Mikrostereolithographie und Elektrotechniken 31 erstellt. Im Wesentlichen kann der Prozess in 2 Teilen (i) Schaffung PEGDA Vorlagen von Mikrostereolithographie und (ii) das Elektro auf die Vorlagen für die Reproduktion des zugrunde liegenden PEGDA Struktur (in diesem Fall einer mikroRing) zusammengefaßt werden. Diese zwei Schritte werden im folgenden (1 und 2) beschrieben. <ol><li> Herstellung von PEGDA Vorlagen von Mikrostereolithographie (microSL) <ol><li> Herzustellen, die Ringe mit einem 2-Schicht-Modell, mit der ersten Schicht (L1) die Basis der Struktur und die zweite Schicht (L2) präsentieren 6 Mikrotaschen mit Hufeisen Morphologies in einer Reihe von Größen von 300 bis 500 um. Die Herstellung von PEGDA Ringe wurde vor kurzem von dieser Gruppe 22 beschrieben. <ol><li> L1 erstellen, indem eine 1,2 cm schwarzer Kreis unter Verwendung eines geeigneten Zeichenprogramm. </li><li> Erstellen L2 in der gleichen Weise, aber sind 8 weiß 0,5 x 0,35 mm hufeisenförmigen Strukturen. Verteilen Sie die kleinen weißen Hufeisenform innerhalb der schwarzen Kreisstruktur. </li><li> Speichern L1 und L2 im JPEG-Format. </li></ol></li><li> In einem dunklen Glasfläschchen, mischen Polyethylenglykoldiacrylat (PEGDA, Mn = 250 g / mol) mit 1% w / w Campherchinon, einem Photoinitiator, auf einem Magnetrührer für 20 min. </li><li> Erweitern Sie den Laserstrahl des Mikrostereolithographie mit einem Teleskoplinsenanordnung Set-up und projizieren es auf einem Computer programmierbare digitale multimirror Gerät (UV-fähigen DMD-Starter-Kit). HINWEIS: Der DMD reflektiert das Bild (in diesem Fall ein Ring) auf einen Spiegel über eine 10 cm Brennweite Rohr-Objektiv. Das Bild wird dann durch das Silber-CoA gerichtetTed Spiegel in ein Fläschchen mit dem photohärtbaren Polymer (PEGDA). </li><li> Einstellen und sorgfältig reinigen Sie die Optik des Mikrostereolithographie einrichten. </li><li> Setz 300 ul der PEGDA Mischung in eine Vertiefung einer 12-Well-Gewebekulturplatte. Sicherzustellen, dass die Vertiefungen mit Teflon oder einem anderen nicht-haftenden Material für die einfache Entfernung der Struktur nach dem Härten vorbeschichtet. </li><li> Schalter auf dem blauen Laser (MBL-III 473 nm; 150 mW) und laden L1 in die ALP3-Basis-Software zuvor auf dem PC installiert ist. Bestrahlen der ersten Schicht während 60 Sekunden. HINWEIS: ALP3-basic ist eine USB-Schnittstelle, die die Verbindung zwischen dem PC und dem Digital Micromirror Device bietet. </li><li> In den Brunnen 250 ul mehrere der PEGDA, laden L2 wie oben beschrieben zu bestrahlen L2 für 60 sek. </li><li> Entfernen Sie die nicht ausgehärtete Polymer und waschen Sie den Ring mit Isopropanol O / N. </li></ol></li><li> Herstellung von biologisch abbaubaren PLGA-Membranen mit Elektro HINWEIS: Die PEGDA Ringe wurden als Template verwendets, über die PLGA wurde mit der Wiedergabe der PLGA zugrunde liegenden Topographie, wie es über diese Vorlagen gesponnen wird elektrostatisch. Nach dem Spinnen wurde die Folie von PLGA-Polymer von dem Kollektor abgezogen. Die endgültige PLGA Membran nicht die PEGDA Ringen gelassen wurden, um die metallische Kollektor gebunden sind, enthalten. <ol><li> Verteilen der PEGDA Ringe auf einem galvaniAluminiumBlech (12 cm x 20 cm) zur Erzeugung eines statischen Elektro Sammler. </li><li> Bringen Sie die Ringe mit leitfähigen Kohlenstoffband. ANMERKUNG: Diese Ringe einmal gebildet ist, kann als Matrize für Elektrowiederverwendet werden. </li><li> Bereiten Sie die Polymerlösung für die Spinnerei. Auflösen PLGA (50:50 DL-Lactid (52 Mol%): Glycolid (48 mol%), 44 kg / mol) in Dichlormethan (DCM) bei 20% w / w-Konzentration. </li><li> Stir O / N vor dem Gebrauch. </li><li> Platz 4 Insulinspritzen (mit stumpfen Enden, 0,8 cm Innendurchmesser Nadeln) auf eine Spritzenpumpe. HINWEIS: Vier Spritzen gewährleistet schnellere Elektro als die Arbeit mit einer einzigen Spritze. </li><li> Laden Sie 2,5 ml PLGA-Lösung in jedem Spritze. </li><li> Elektrospinnen mit 30 ml / min Volumenstrom und Spannungen von 12 bis 15 kV. Lassen einen Abstand zwischen den Nadeln und dem Kollektor 15 cm. </li><li> Elektrospinnen für 1 Stunde und 30 Minuten und schließlich vorsichtig schälen PLGA elektroBlatt vom Kollektor Unterstützung der PEGDA Ringen. </li><li> Schneiden Sie die elektro Gerüste in 22 mm Durchmesser Kreise mit einem kreisrunden Loch Punch und Verlassen der Ringstruktur in der Mitte positioniert. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Langzeitspeicherung von PLGA Mikrofabrizierte Membranen Hinweis: Die PLGA Ringe wurden hergestellt und von akkreditierten externen Unternehmen sterilisiert; Proben wurden bei einer externen Dosisbereich von 25-40 kGy bestrahlt. <ol><li> Montieren Sie die Membran in einem kleinen Behälter (Kunststoff-Petrischale) und legen Sie sie in einer Klasse Tasche medizinisch. </li><li> Filterpapier verwenden, um kleine Filtertüten für die Trockenmittel erstellen. To Schaffung der Taschen, klappen Sie den Papierfilter (125 mm Durchmesser) und schneiden Sie die resultierende Halbkreis in der Mitte; versiegeln Sie die Enden zusammen mit Klebeband. <ol><li> Füllen drei Filterpapierbeutel mit 1 g Kieselsäure orange, Kobalt (II) chlorid und Kupfer (II)-Sulfat sind. </li><li> Setzen Sie die drei Beutel Trocknungsmittel in der Klasse Tasche zusammen mit dem medizinischen elektro Membran. </li></ol></li><li> In die Tasche einen handelsüblichen sechs Spot Feuchtigkeitsindikator Karte, um jede Ansammlung von Feuchtigkeit während der Lagerzeit zu erkennen. </li><li> Verwenden Sie ein Vakuum-Wärmesiegelmaschine Vakuum und den Beutel. </li><li> Senden Sie die Ringmembranen an ein externes Unternehmen für γ-Bestrahlung. </li><li> Speicher γ-bestrahlt PLGA Membranen in einem weiten Temperaturbereich von -20 ° C bis +37 ° C in einer feuchten Umgebung in einem Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Post Lagerung, Prüfung der Feuchtigkeitsanzeiger, um zu bestätigen, dass die Höhe der Luftfeuchtigkeit ist unter 30%. </li><li> USE Rasterelektronenmikroskopie (SEM), um die Faserintegrität zu bewerten. </li></ol> 3. Isolierung Limbale Explantate Kaninchen Limbus Explantate wurden von Kaninchenaugen (von einem Bauernhof, wo Kaninchen werden für den Verzehr gezüchtet werden) isoliert. <ol><li> Desinfizieren Sie die Kaninchenaugen mit antiseptischen Lösung (3%). </li><li> Die Augen zu reinigen, indem Sie alle rund um die Hornhaut überschüssiges Gewebe. </li><li> Trenne die Limbus-Bereich (als dünne Kreisfläche zwischen der Hornhaut (transparent) und die Sklera (weiß) bezeichnet) von dem Rest der Hornhaut mit einem Präpariermikroskop. </li><li> In Segmente (ca. 1,5 cm lang) unter der Dissektionsmikroskop geschnitten. </li><li> Desinfizieren Sie die Limbus-Segmente in 1,5% antiseptischen Lösung für 1 min. </li><li> Schneiden Sie die Limbus-Segmente in kleine Stücke (100-500 um) mit einer Skalpellklinge. </li><li> Speichern die kleine Stücke von Gewebe in Kulturmedium (DMEM + Glutamax: Ham&#39;s F12 (1: 1), 10% fötales Rinderserum, 1 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 2,5 ug / ml Amphotericin, 10 ng / ml EGF und 5 ug / ml Insulin) bei 37 ° C und 5% CO 2 bis zur Verwendung (nicht mehr als 60 min). </li></ol> 4. Auswachsen von Zellen aus Limbale Explantate Kaninchen Limbus-Explantate wurden auf beiden frisch gesponnenen mikrogefertigten Membranen und Membranen, die vakuumverpackt und für 6 Monate bei -20 ° C gelagert waren gegeben. <ol><li> Beschichten der Ringgerüste mit 15 ul Fibrinkleber (1: 1-Mischung von Fibrinogen aus humanem Plasma in einer Konzentration von 18,75 mg / ml und Thrombin aus Humanplasma in einer Konzentration von 2,5 U / ml) mit einem Zellschaber zum Verteilen des Fibrins gleichmäßig. </li><li> Legen Sie die Gewebeexplantaten direkt auf den PLGA Mikrotaschen mit einer 25 G-Nadel und ein Binokular. </li><li> Fügen Zellkulturmedien sehr vorsichtig, um das Lösen der Explantate. <ol><li> Medien ändern alle 3 Tage (in Abschnitt 3.7 beschriebenen Medien Rezept) und kEEP in der Kultur für 2 Wochen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Befestigen Sie die Proben mit 3,7% gepuffertem Formaldehyd für 10 min, gefolgt von 3 Waschschritten mit PBS. </li><li> Durch Inkubation in 1 ug / ml 4 &#39;gegenfärben, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) oder Propidiumiodid (PI) für 10 min bei RT. </li><li> 3 mal waschen in PBS und die Proben mit Folie abgedeckt speichern. </li><li> Bild die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop bei Wellenlängen von 543 nm und 800 nm (Zwei-Photonen). </li></ol> 5. Einrichten Kaninchen Wounded Cornea 3D-Modelle <ol><li> Reinigen und desinfizieren Sie die Kaninchenaugen wie oben beschrieben. </li><li> Umsponnen die Kaninchenaugen durch Eintauchen in 0,14% Ammoniumhydroxid für 5 min. </li><li> Die Augen spülen in PBS und abkratzen das Epithel mit einem Sklerotom Messer. </li><li> Schneiden und zu isolieren, die Hornhaut-Lederhaut Schaltfläche Entfernen von Restgewebe. </li><li> Legen Sie die Hornhaut epithelialen Seite nach unten aufeine sterile Becher füllen und mit 0,5% Agar in DMEM gemacht. </li><li> Einmal eingestellt, legte die Hornhäute epithelialen Seite nach oben in kleinen Petrischalen und fügen Kulturmedien (wie oben beschrieben Rezept) bis zum Limbus-Bereich. HINWEIS: Decken Sie das ganze Hornhaut; halten die Orgelkultur an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. </li></ol> 6. Isolierung von Limbale Explantate und Integration von Ring Gerüste in der Kaninchenhornhaut 3D-Modelle <ol><li> Beschichten der Ringmembranen mit 15 ul Fibrinkleber (1: 1-Mischung von Fibrinogen in einer Konzentration von 18,75 mg / ml und Thrombin in einer Konzentration von 2,5 U / ml) .Use einem Zellschaber, wie oben beschrieben. </li><li> Legen Sie die Gewebeexplantaten direkt auf den PLGA Mikrotaschen mit einer 25 G-Nadel und ein Binokular. </li><li> Legen Sie die Ringe mit den Gewebe Explantate auf den entblößten Hornhäute mit den Explantaten nach oben und an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche Bedingungen. (Diese Bedingungen sind zuvor beschrieben worden 22). </li><li> Pflegen Sie die Organkultur-Modellen für4 Wochen einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 Wechsel der Medien alle 2 Tage. </li></ol> 7. Bewertung der Hornhaut-Regeneration und Stammzell Wartung <ol><li> Nach 4 Wochen fixieren die Hornhaut mit 3,7% Formaldehyd. </li><li> Verarbeiten die Hornhäute für konventionelle Histologie bis 6 um Paraffinschnitten zu produzieren. </li><li> Fleck mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E). </li><li> Für Immunzytochemie, Entwachsen die Abschnitte in Xylol (3 min) und rehydratisieren in 100% Ethanol (1 min), 70% Ethanol (1 min) und destilliertem Wasser (2 min). </li><li> Abgrenzung der Abschnitte mit einem Dako Stift, um kleine Bereiche begrenzen und vermeiden übermäßige Verwendung von Antikörper. <ol><li> Behandeln das abgegrenzte Bereiche mit 0,05% Trypsin (100 ul) für 20 min (37 ° C). </li></ol></li><li> Gründlich mit PBS und 100 l 10% Ziegenserum (Blockierung) für 1 Stunde. </li><li> Die Proben mit 100 ul des monoklonalen Maus-Antikörpers cytokera inkubierenZinn 3 (CK3) und 100 ul von p63 in 1% Ziegenserum O / N bei 4 ° C ist. </li><li> Waschen mit PBS und Behandlung mit 100 ul biotinylierten sekundären anti-Maus-Antikörper (1: 1000 in 1% Ziegenserum) 1 h bei RT. </li><li> 100 ul FITC-Streptavidin (1: 100 in 1% Ziegenserum) für 30 min bei RT. </li><li> Behandlung der Proben mit DAPI, wie oben beschrieben. </li><li> Bild die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop bei Wellenlängen von 800 nm (Zwei-Photonen-) und 488 nm auf. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese Studie beschreibt (a) ein Verfahren zur Herstellung elektro Membranen, Mikroformen in ihnen und (b), wie solche Membranen für die klinische Verwendung von Vakuumverpackung, Gamma-Bestrahlung und Lagerung vor der Verwendung herzustellen. In dieser speziellen Anwendung haben wir PLGA-Membranen, die Mikrotaschen, die die physikalischen Eigenschaften der Limbus-Stammzellnischen nachahmen entwickelt. Die Ziele dieser Studie sind (i) die Methoden beschreiben, um dem Leser das notwendige Wissen, um in dem Beitrag der Stammzellnischen, Geweberegeneration und (ii) den Leser mit einem besseren Verständnis entwickeln und fertigen Gerüste enthält Mikroformen für die Forschung , wie elektro Gerüste für lange Zeiträume zu speichern. In Bezug auf die klinische Anwendung, ist von größter Bedeutung, die die Speicherung der Ringmembranen. In dieser Arbeit wurde die Verschlechterung der Ring über einen Zeitraum von 6 Monaten untersucht. Abbau desMembranen wird durch Hydrolyse von einfach halten die Membranen frei von Feuchtigkeit wird der Prozess gestoppt angetrieben, so. Blackwood et al. Berichtet, dass durch Variation des Verhältnisses von PLA zu PGA, die Verschlechterung der Membran ändert 32. Diese Untersuchung zeigte auch, dass durch die Erhöhung der Menge des PGA, die Abbaurate der elektro Membranen in vivo 22 erhöht. Hier hat es sich gezeigt, dass mit Vakuumverpackung die Membranen zusammen mit etwas Trockenmittel und Bestrahlen und speichert sie bei niedrigen Temperaturen für 6 Monate, gibt es keine Änderung in der Faserintegrität und Abbau. Derzeit beträgt 6 Monate so weit wie wir mit diesen Membranen, die Mikrotaschen aber Speicherdaten für 1 Jahr auf Normalelektro Membranen bei -20 ° C 22 gemeldet und wir haben jetzt unveröffentlichte Daten für ihre Lagerung bei -20 ° C untersucht für 2 Jahre ohne irgendwelche Anzeichen von Zersetzung. So zur Langzeitlagerung, es wäre empfehlenswert, um sie trocken bei -20 speichern6, C, aber es ist möglich, sie bei Raumtemperatur lagern, auch in Indien für mindestens 6 Monate (möglicherweise viel länger). Die Einbeziehung einer Feuchtigkeitsindikator gibt eine einfache Kontrollmöglichkeit, dass die Verpackung Membranen trocken in diesem Fall werden sie fit für den Zweck sein gehalten. Übertragung von Zellen, die aus diesen Ringen um 3D-Modelle Hornhaut wurde bei der Platzierung in den Limbus Explantate Mikrotaschen gezeigt. Diese Gruppe berichtete kürzlich Übertragung von Zellen auf einem in vitro-Modell Kaninchenhornhaut, indem Explantate auf Normal PLGA-Membranen (Membranen ohne Ringstrukturen) 24. Mit Hilfe der vorliegenden mikro Gerüste Zelltransfer wurde einen Schritt weiter als wir jetzt gezielt zu lokalisieren Gewebeexplantaten innerhalb der Mikrostrukturen. Die Fähigkeit, die Explantate direkt in den Nischen Ort ermöglicht es dem Chirurgen, die Membranen direkt in den Operationssaal Vermeidung der Notwendigkeit eines Reinraums zum ersten erweitern die Limbus-Stammzellen zu verwenden. Obwohl dieses Stück work hat sich auf die Entwicklung von Geräten für die Hornhauterkrankung konzentriert, kann dieser Mikrotechnik auch für die Entwicklung von Geräten für viele andere Anwendungen angewandt werden. Zukünftige Arbeit wird die Herstellung von Konstrukten, die für die Regeneration anderer Gewebe, wie Haut und Knochen zu erkunden. Während der anfänglichen Konstruktion und Fertigung der Mikrostrukturen PEGDA kann zeitaufwendig sein, einmal hergestellt, können die Strukturen oft ohne Abbau verwendet werden. Bei der späteren Herstellung von PLGA mikro biologisch abbaubaren Membranen durch Elektrospinnen bei einer vergleichbaren Geschwindigkeit zu der Herstellung von einfachen (unstrukturierten)-Membranen nach der Montage des Kollektors durchgeführt werden. Obwohl in dieser Arbeit haben wir Mikrostereolithographie zur Herstellung der Formen verwendet, können andere Herstellungsverfahren wie beispielsweise 3D-Drucken oder Spritzen verwendet werden. Dementsprechend ist die zugrunde liegende Form könnte von anderen Polymeren oder Metallen anstelle von PE werdenGDA. Als solche ist diese Technik sehr vielseitig und können die Forscher einfach die Methode, um ihre eigenen Bedürfnisse und Einrichtungen entsprechen anzupassen. Das hauseigene Mikrostereolithographie Set-up in dieser Studie verwendet wird nicht zulassen, die Herstellung von Konstrukten mit Funktionen unter 30 um; Dies ist keine Einschränkung für die hier beschriebene Anwendung Hornhaut aber entscheidend bei der Gestaltung von anderen Modellen sein können. In diesem Fall andere Techniken wie 2 Photonen-Polymerisation (2PP) könnte von Interesse sein, aber die Elektro Technik möglicherweise nicht die Wiedergabe von Strukturen auf der Sub-Mikron-Skala erlauben (dies wird derzeit von unserer Gruppe untersucht). Kritischen Schritte in dem Herstellungsverfahren (i) Vermeidung des Überhärtung der PEGDA Vorlagen, die durch die Anpassung der Zeit und Menge an Photoinitiator gesteuert werden kann. (Ii) Steuerung der Elektrospinnbedingungen, wie Temperatur und Feuchtigkeit. (Iii) Speicherung entsprechend den electrospun Ring Membranen unter Verwendung von Vakuum-Verpackung und Trockenmittel. Zusammenfassend indem Limbus Gewebeexplantaten innerhalb der Mikromerkmale der Membran haben wir Zellauswuchs aus den Explantaten auf der Nischen, Zellübertragung auf einem Kaninchenhornhaut verletzt und anschließende Reepithelisierung der Hornhaut gezeigt. Der Abbau der bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert Membranen wurde untersucht und ein Verpackungsprotokoll, das langfristige Lagerung von Membranen ermöglicht wurde entwickelt, wobei letztere weiter zu entwickeln Membranen für die klinische Verwendung ist.

Die Hornhaut, dem zentralen avaskulären äußersten Gewebe des Auges, ist eine der wichtigsten Gewebe Vision 1 beteiligt. Es gibt verschiedene Arten von Zellen, die die Funktion der Hornhaut aufrechtzuerhalten. Die obere äußere Schicht der Hornhaut besteht aus Epithelzellen, die ungefähr 5-7 Schichten in der Dicke 2 sein kann. Diese Schicht verhindert das Eindringen von Bakterien in die Hornhaut 3 und ermöglicht Zutritt von Sauerstoff 4. Es wurde berichtet, dass die Stammzellen des Hornhautepithels liegen in Nischen oder Krypten (mit einer Größe von 120-150 um) am Randbereich der Hornhaut als Limbus 5,6 bekannt. Da die Stammzellen teilen, die Tochterzellen auch als vorübergehende Verstärkerzellen bekannt reisen aus den Nischen und als Divisions weiterhin die Zellen zentripetal nach innen und nach oben bewegen, was zu terminal differenzierten Zellen in der zentralen Hornhautbereich 7,8. Diese Zellen werden routinemäßig weg mit dem Blinzeln des Auges E abgewischtxposing neueren Zellen unter 9. Zusätzlich dazu, dass die Lage der epithelialen Stammzellen spielt die Limbus auch eine Rolle bei der Beibehaltung der vaskularisierten Bindehaut von der Hornhautbereich 10. Schäden an den Limbus konnte durch thermische / chemische Verbrennungen, Strahlung und auch genetische Krankheiten 10 verursacht werden. Wenn dies geschieht, wird der Limbus Barriere nach unten so dass die Bindehautzellen auf die Hornhaut zu bewegen, Vaskularisierung der Region, was zu Schmerzen und Blindheit in einigen Fällen gebrochen. Der Zustand wird als Limbusstammzellinsuffizienzen (LSCD) 10 bekannt. Verschiedene natürliche Substrate wie möglich Stammzellträger für die Unterstützung in der Hornhautregeneration berichtet. So wurden beispielsweise auf Kollagenbasis Membranen Dravida et al. 11 und Rama und Mitarbeiter 12 verwendet berichteten über die Verwendung von Fibrin in einer Studie mit 112 Patienten. Derzeit jedoch die am häufigsten verwendete Methode der Behandlungist die menschliche Eihaut aus einer Gewebebank und Kultur Limbus Epithelzellen an der Oberfläche 13,14 zu verwenden. Sobald eine Monoschicht gebildet hat, wird die Amnionmembran bis auf die beschädigte Hornhaut, die alle Bindehautzellen und Narbengewebe chirurgisch aus es vor diesem Zelltransplantation 14 entfernt hat geklebt Zell-Seite. Die Amnionmembran verschlechtert innerhalb von Wochen bis Monaten verlassen die Epithelzellen auf das entblößte Fläche angebracht, um das Epithel 15,16 regenerieren. Diese Technik wurde bei der Wiederherstellung Vision erfolgreich aber es gibt immer noch ein paar praktische Fragen, die seine weit verbreitete Aufnahme klinisch zu beschränken. Wie der Amnionmembran ist menschliches Gewebe es braucht, um zu unterziehen Screening mit gute Gewebebankverfahren, bevor sie für die Zelltransplantation bei Patienten eingesetzt. Dieses Screening senkt nur die Gefahr der Übertragung von Krankheiten, jedoch nicht vollständig beseitigen 17. Darüber hinaus gibt es Berichte von Variabilität in der performance der Amnionmembran durch inter Spender Variation 18,19 und 19,20 verschiedene Verarbeitungsmethoden. Neben dem kleinen Risiko der Krankheitsübertragung besteht die Forderung, für die OP-Zentren, um Zugriff auf gut geführte Gewebebanken, nicht für alle verfügbar zu haben. Obwohl die Amnionmembran relativ erfolgreich ist, gibt es einen Bedarf für die Entwicklung von neuen synthetischen biologisch abbaubaren Zellträger Alternativen für die Behandlung von Hornhauterkrankungen. Synthetische Träger würde die Notwendigkeit für das Bankverfahren sowie die Beseitigung der kleinen Risiko der Krankheitsübertragung und Inter-Spender Variabilität zu überwinden. In diesem Sinne sind Materialien wie Polyethylenglykol 21,22 und 23,24 PLGA wurden untersucht. Bei der Entwicklung eines synthetischen Alternative zu den menschlichen Eihaut gibt es auch die Möglichkeit, in sie wünschenswerte Eigenschaften zu entwerfen, um hoffentlich helfen, das Überleben der kultivierten Zellen. Die inclusion von Mikrostrukturen innerhalb Biomaterial Geräte für die gezielte Steuerung des Zellverhaltens ist ein aufstrebendes Gebiet von Interesse. Viele Autoren haben berichtet, Arbeit an der Entwicklung von künstlichen Stammzellen Nischen 25-30. Diese Gruppe hat kürzlich die Schaffung einer mikro PEGDA Fibronektin-biofunktionalisierte künstlichen Limbus zur Lieferung von Limbus-Epithelzellen 22 und eine Methode für die Herstellung elektro biologisch abbaubare Membranen, die mikrogefertigte Taschen für die Unterstützung der Limbus-Epithelzellen 31. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine neue Fertigungstechnologie für die Entwicklung von Geräten mit Mikrostruktur Biomaterial, das in einem Ausmaß, die Mikroumgebungen, in denen Stammzellen befinden sich im Körper nachahmen zu entwickeln. Wir haben eine Technik, die Mikrostereolithographie und Elektro kombiniert, die die Herstellung von biologisch abbaubaren mikrostrukturierte Membranen, die grea zeigen können entwickeltt Potenzial für die Geweberegeneration Anwendungen. Es ist wichtig zu bemerken, dass, obwohl in dieser Arbeit hat sich diese Technik auf die Herstellung von Ringen für die Hornhautregeneration angewendet wurde, kann die Technologie auf die Herstellung von Vorrichtungen zur Regeneration von einer breiten Palette von epithelialen Geweben, beispielsweise Haut, oral angewendet werden, Schleimhaut, Darm, Atemwege, Blase und Epithelien. Insbesondere wird in dieser Studie haben wir eine synthetische biologisch abbaubare Membran, die in einer ähnlichen Weise zu der Amnionmembran wirkt, um Zellen der Hornhaut liefern entwickelt. Diese Membran enthält Mikrotaschen von rund 300 um (größer als die Limbus-Krypten der Pallisades von Vogt (ca. 150 um)). Schließlich haben wir eine Verpackung Protokoll, das diese Membranen bei -20 ° C für mehr als 6 Monate, ohne Anzeichen einer Störung gespeichert werden können etabliert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Name of&#160; reagents/material/equipment</td>
			<td style="width:173px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:180px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:183px;">Poly lactic-co-glycolic acid</td>
			<td style="width:173px;">Purac</td>
			<td style="width:157px;">PDLG5004</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:183px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich Or Fisher</td>
			<td style="width:157px;">270997 Or D/1850/17</td>
			<td style="width:180px;">&#62;99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser</td>
		</tr>
		<tr height="113">
			<td height="113" style="height:113px;width:183px;">Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board &#38; Starter Kit</td>
			<td style="width:173px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:157px;">1076N732 (UV)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">473 nm Laser</td>
			<td style="width:173px;">Laser 2000</td>
			<td style="width:157px;">MBL-III</td>
			<td style="width:180px;">150 mW</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:183px;">Poly (ethylene glycol) diacrylate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">475629</td>
			<td style="width:180px;">Mn = 250g/mol&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">DEMEM + Glutamax</td>
			<td style="width:173px;">Fisher</td>
			<td style="width:157px;">12077549</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:183px;">Ham&#8217; s F12</td>
			<td style="width:173px;">Labtech biosera</td>
			<td style="width:157px;">LMH1236/500</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:173px;">Labtech biosera</td>
			<td style="width:157px;">FB-1090/50</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">EGF</td>
			<td style="width:173px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:157px;">236-EG-200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Insulin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">91077C-1G</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Amphotericin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">A2942-100ml</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P0781-100ml</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="39" rowspan="2" style="height:39px;width:183px;">DAPI</td>
			<td rowspan="2" style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:157px;">32670</td>
			<td rowspan="2" style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P4864</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Thrombin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">T9326</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">F3879</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">p63</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P3737</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">CK3</td>
			<td style="width:173px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:157px;">CLB218</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:173px;">SLS</td>
			<td style="width:157px;">HHS16-500ML</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Eosin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">HT110232-1L</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:183px;">Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch</td>
			<td style="width:173px;">Riverside Medical Ltd. Derby, UK</td>
			<td style="width:157px;">Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:183px;">gamma- irradiation (Sterilisation)</td>
			<td style="width:173px;">Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40KGy</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:183px;">Silica gel orange</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">10087</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:183px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">232696</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:183px;">Copper (II) sulphate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">C-1297</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:183px;">Six spot humidity indicator card</td>
			<td style="width:173px;">SCC, USA</td>
			<td style="width:157px;">6HIC200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:183px;">Vacuum heat seal machine</td>
			<td style="width:173px;">Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td>
			<td style="width:157px;">VS518</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:183px;">Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls</td>
			<td style="width:173px;">Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td>
			<td style="width:157px;">BR2805</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:183px;">Scanning Electron Microscopy (SEM)</td>
			<td style="width:173px;">Philips/FEI XL-20 SEM</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:183px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:173px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:183px;">Videne Antiseptic Solution</td>
			<td>Ecolab, Swindon, UK</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;">3%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combination of microstereolithography and electrospinning to produce membranes equipped with niches for corneal regeneration

Hornhautprobleme betreffen Millionen von Menschen weltweit ihre Lebensqualität deutlich zu reduzieren. Hornhauterkrankungen kann durch Krankheiten wie Aniridia oder Steven-Johnson-Syndrom sowie von externen Faktoren wie Verätzungen oder Strahlung verursacht werden. Aktuelle Behandlungen sind (i) die Verwendung von Hornhauttransplantaten und (ii) die Verwendung von Stammzellen im Labor erweitert und auf Trägern (zum Beispiel Amnionmembran) geliefert wird; Diese Behandlungen sind relativ erfolgreich, aber leider sind sie nach 3-5 Jahren scheitern. Es besteht ein Bedarf zur Entwicklung und Herstellung neuer Hornhaut Biomaterial Geräte in der Lage, im Detail imitieren die physiologische Umgebung, in der Stammzellen befinden sich in der Hornhaut. Limbus-Stammzellen in den Limbus (Kreisfläche zwischen Hornhaut und Sklera) in Nischen als Palisaden Vogt bekannt ist. In dieser Arbeit haben wir eine neue Plattform-Technologie, die zwei modernste Fertigungstechniken (Mikrostereolithographie und electrospinn kombiniert entwickelting) für die Herstellung von Membranen, die Hornhaut in einem gewissen Ausmaß der Limbus imitieren. Unsere Membranen enthalten künstliche Mikrotaschen, die Zellen mit Schutz bieten als die Palisades von Vogt zu tun in die Augen zielen.

Elektromikrogefertigt Ringe wurden unter Verwendung einer Kombination aus Mikrostereo und Elektro (1 und 2) hergestellt. PEGDA Ringe verschiedener Größen wurden mit Mikrostereo (3) hergestellt ist; Diese Technik ermöglicht die Herstellung Strukturen in der Größenordnung von cm und der gleichzeitigen Aufnahme von Mikrostrukturen. In diesem Fall Ringe mit Durchmessern im Bereich von 1,2 bis 1,6 cm, enthaltend Mikrotaschen von 350-500 um wurden hergestellt (Figur 4). In Bezug auf Herstellung, Sterilisation und Verpackung von Materialien für zukünftige klinische Anwendung wurde gefunden, daß die Vakuumverpackung in medizinischer Qualität Taschen signifikant verbessert die Fähigkeit zur Langzeitlagerung von PLGA Membranen (5) zu erreichen; die Verwendung von einem medizinischen Beutel (PET / Folien / LDPE) mit einer Dicke von 0,12 mm erlaubt es uns, eine längere Haltbarkeit erreichen. Dies wurde durch das Senden membr suchtane für unsere Helfer in Indien und Membranen wurden über einen Zeitraum von Monaten bei -20 ° C bei Raumtemperatur und bei 37 ° C in feuchter Umgebung gezielt (a feuchten Inkubator) gespeichert. Figur 5 zeigt, daß mit den absichtlich provozierenden Lagerbedingungen bei 37 ° C unter feuchten Bedingungen wurden die Membranen nur stabil nach ca. 1 Monat unter Nicht-Vakuum-Bedingungen verpackt, aber 3 erreicht Monaten Lagerung unter Vakuum verpackt Bedingungen (Figur 5 und Tabelle 1). Tabelle 1 zeigt die Verbesserung der Lagerbedingungen, die auch unter den Bedingungen ausgewählt förderlich für die Wasseraufnahme und Quellung Faser, wenn man darauf achtet, Wahl der Tasche verwendet werden erzielt werden kann. Die Ringe unterstützt Zellauswuchs von Limbus Explantate in verschiedenen Bedingungen (i) Ringe frisch zubereitet und (ii) Ringe für 6 Monate (6) gespeichert. Nach 4 Wochen wurde der Zellübertragung erreicht, wenn placing die PLGA-Membranen auf 3D-Modelle verwundet. Zellen wuchsen aus den Gewebe-Explantate auf den Membranen der Erstellung eines neuen Epithel auf den zuvor freigelegten Hornhaut (7) angeordnet ist. Positiv (Hornhaut ohne Behandlung) und Negativkontrollen (Hornhaut verletzt) ​​wurden ebenfalls in der Kultur für die gleichen Zeiträume aufrechterhalten. Die negativen Kontrollen bestätigten das Fehlen der Bildung von neuem Epithel in Abwesenheit von jeglichen zugefügten Zellen. Immunzytochemie gezeigt, dass die Zellen aus wachsen aus den Explantaten waren Hornhaut-Epithelzellen, da sie positiv für die Hornhaut-Differenzierungsmarker CK3 (7E) waren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Mikrostereolithographie Einrichtung für die Erstellung von PEGDA Ringen. her.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung des Elektrospinnverfahren mit PEGDA mikrofabriziert Ringe als Vorlagen. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg" width="500" /> Figur 3 (A) zeigt ein Beispiel einer statischen Kollektor (elektroplattierten Aluminiumblech mit PEGDA Ringe) zum Spinnen von mikrogefertigten PLGA Membranen. (B) und (E) zeigen verschiedene elektro Matten aus statischen Kollektoren abgezogen. (C) PEGDA Vorlagen unterschiedlicher Größen Hervorhebung der Vielseitigkeit der Verwendung von Mikrostereolithographie zur Herstellung der darunter liegenden Oberfläche. (D) zeigt ein PLGA mikrogefertigt Replik./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. REM-Aufnahme einer PEGDA Ring mit einem Hufeisen Mikrostruktur (A); hoher Vergrößerung REM-Aufnahme einer mikro Tasche (B). Phasenkontrastbild eines PLGA-Ring mit einem Hufeisen Mikrostruktur (C); hoher Vergrößerung Phasenkontrastbild einer mikro Tasche (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5: Einfluß der Temperatur und der Zeit der Lagerung von Vakuum und ohne Vakuum verpackt PLGA (50:50) Membranen (44 kg / mol) mit mikro-gefertigte Ringe über 6 Monate. Membranintegrität wurde als vollständig intakt Fasern erzielt (+++), einige Faserquellungs- (++), Faserzusammenführen (+) oder keine intakten Fasern (-). REM-Aufnahmen und drei Trockenmittel (Silica orange, Kobalt (II) chlorid und Kupfer (II)-Sulfat) zeigen keine Veränderungen in der Faserintegrität oder Feuchtigkeit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" width="500" /> Abbildung 6 zeigt Fluoreszenzbilder Auswuchs der LEC von Limbus-Explantate auf frisch zubereitete biologisch abbaubare PLGA Ringe (A, B) und an den Ringen nach 6 Monaten Lagerung bei -20° C (C, D). Bilder (A) und (B) entsprechen, um Zellen mit DAPI (blau) und Propidiumiodid (rot) angefärbt. Bild B ist eine orthogonale Ansicht eines konfokalen z-Stapel von einem Explantat auf einer mikro Tasche platziert. Bilder (C) und (D) zeigen eine positive Färbung für p63 (grün). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" width="500" /> Abbildung 7 (A) zeigt ein Kaninchen verwundet Hornhaut-Modell mit einem Ring-Gerüst und Gewebeexplantaten auf dem Schafott, die zuvor mit Fibrinkleber beschichtet wurde entfernt (B) und (C) sind positive und negative Kontrollen. Die positive Kontrolle ist eine frische Rabbiner<html> . t Hornhaut und die negative Kontrolle eine Hornhaut, wo das Epithel wurde absichtlich entfernt (die negative Kontrolle wurde ebenfalls für 4 Wochen kultiviert) (D) ist eine H &amp; E-Bild einer Hornhaut Gewebezüchtung nach 4 Wochen in Kultur; Die Abbildung zeigt die neue vielschichtige Epithel von den Zellen, die sich aus den Explantaten auf den Nischen platziert gebildet (E) ist ein Bild, das zeigt Immunzytochemie Zellauswuchs von einem Limbus Explantation. Kerne sind mit DAPI (blau) gefärbt und die Zellen zeigt eine positive Färbung für Zytokeratin 3, eine Hornhautdifferenzierungsmarker (grün). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="611"><tbody><tr height="22"><td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:163px;"> PLGA (50:50) </td><html> x; &quot;&gt; Faserintegrität für Membranen bei 37 ° C feucht gelagert </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> Tag 0 </td><td style="width:64px;"> 1 Monat </td><td style="width:64px;"> Monat 2 </td><td style="width:64px;"> Monat 3 </td><td style="width:64px;"> Monat 4 </td><td style="width:64px;"> Monat 5 </td><td style="width:64px;"> Monat 6 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:163px;"> Nicht-Vakuumverpackt </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="67"><td height="67" style="height:67px;width:163px;"> Abgesaugt (Bag A) (PE, PA Composite) Stärke: 0,14 mm </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td>64px; &quot;&gt; - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:163px;"> Abgesaugt (Bag B) (PET / Folie / LDPE) Stärke: 0,75 mm </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> +++ </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Wirkung von Vakuum und verschiedenen Speicher Taschen Integrität von PLGA (50:50)-Membranen (44 kg / mol) untersucht mehr als 6 Monaten Lagerung. Membranintegrität wurde als voll intakt Fasern (+++), einige Faserquellung erzielt (++), Faserzusammen (+) oder keine intakten Fasern (-).

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Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Wir berichten über ein Verfahren zur Herstellung von Mikrotaschen in elektro Membranen, bei denen auf das Zellverhalten zu untersuchen. Insbesondere beschreiben wir eine Kombination von Mikrostereo und Elektro zur Herstellung von PLGA (Poly (lactid-co-glycolid)) Hornhaut Biomaterial Geräten mit Mikromerkmalen ausgestattet.

Kombination von Mikrostereolithographie und Elektrospinnen auf Membranen Ausgestattet mit Nischen für die Hornhautregeneration Produzieren

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K Aufrufe.  University of Sheffield.  Wir berichten über ein Verfahren zur Herstellung von Mikrotaschen in elektro Membranen, bei denen auf das Zellverhalten zu untersuchen. Insbesondere beschreiben wir eine Kombination von Mikrostereo und Elektro zur Herstellung von PLGA (Poly (lactid-co-glycolid)) Hornhaut Biomaterial Geräten mit Mikromerkmalen ausgestattet. 

Serie: Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Elektrospinnen Grundlagen: Optimierung Solution und Geräteparameter

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

Forschung

Biotechnik

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Herstellung der lichtreaktions Membranen durch eine Kombinierte Oberflächen-Pfropfen und Postmodification Prozess

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Anpassung der Elektrospinnverfahren für einen Dreischicht stellen drei einzigartige Umgebungen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Atemwegswand

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

Zusammenführen von Ionenkonzentration Polarisierung zwischen Juxtaposed Ionenaustauschermembranen zu blockieren die Ausbreitung der Polarisations Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Synthese von Hydrogelen mit Antifouling-Eigenschaften als Membranen für die Wasserreinigung

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Elektrospinnen Schreiben von dreidimensionalen Poly(ε-caprolactone) Gerüste mit steuerbaren Morphologien für Tissue Engineering Anwendungen zu schmelzen

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...