Mein Labor ist also daran interessiert zu verstehen, wie Auge und Gehirn zusammenwachsen. Diese Technik ermöglicht es uns zu untersuchen, wie der retinale Input das Wachstum und die Entwicklung des Gehirns beeinflusst. Die chirurgische Entfernung eines Auges aus dem lebenden Larvenzebrafisch, gefolgt von der Beobachtung des optischen Tektums, ermöglicht es uns, innervierte und denervierte tektale Lappen innerhalb desselben Tieres und zwischen Tieren zu vergleichen.
Die Kombination dieser Technik mit modernen molekularen Ansätzen kann neue Einblicke in die Mechanismen geben, die der neuronalen Entwicklung, Regeneration und Degeneration zugrunde liegen. Schließen Sie zunächst die Kathoden- und Anodendrähte an die Stromversorgung an. Befestigen Sie die Krokodilklemme am Ende des Kathodendrahtes an einer teilweise begradigten Büroklammer und setzen Sie die Büroklammer in die Kaliumhydroxidlösung ein und befestigen Sie sie an der Seite des Glases.
Befestigen Sie den Krokodilklemme des Anodendrahtes am Hals des Nadelhalters. Drehen Sie die Leistung auf ungefähr 20 Volt und tauchen Sie den Wolframdraht in die Kaliumhydroxidlösung, wobei Sie den Draht in einem Winkel aus der Lösung ziehen, um den Draht elektrolytisch zu einer feinen Spitze zu schärfen. Überprüfen Sie die Nadelspitze unter dem Seziermikroskop, um sicherzustellen, dass sie scharf genug ist.
Die gekrümmte Nadelspitze entsteht, wenn die scharfe Nadel durch sanftes Berühren der Petrischale gebogen wird. Verwenden Sie am Tag der Operation eine Weidepipette mit breiter Bohrung, um 10 bis 15 Larven auf eine 35-Millimeter-Petrischale zu übertragen, die mit frischem E3 gefüllt ist. Fügen Sie der Larve drei bis fünf Tropfen Anästhetikum hinzu. Um festzustellen, ob die Larven ausreichend betäubt sind, achten Sie auf mangelnde Berührungsreaktion.
Fügen Sie zwei bis drei weitere Tropfen des Anästhetikums hinzu, wenn die Larven nach drei Minuten immer noch auf Berührungen reagieren, und bewerten Sie sie neu. Um die Larve für die Operation zu immobilisieren, nehmen Sie eine Larve mit nur einer geringen Menge E3 in eine schmale Glasweidepipette. Als nächstes nehmen Sie etwa 200 Mikroliter geschmolzenen 1% niedrigen Schmelzpunkt oder LMP-Agarose in die Pipette auf, die die Larve enthält, und mischen Sie, um sicherzustellen, dass die Larve in der LMP-Agarose suspendiert ist. Legen Sie den Deckel einer 35 Millimeter großen Petrischale mit dem Gesicht nach oben unter das Seziermikroskop, dann spritzen Sie die Larve und die Agarose auf den umgedrehten Petrischalendeckel.
Verteilen Sie die Agarose so, dass sich die Larve in der Mitte des Tropfens befindet. Manövrieren Sie die Larve mit einer stumpfen Wolframnadel schnell, aber vorsichtig so, dass sie seitlich ist und ein Auge nach oben zeigt. Warten Sie einige Minuten, bis die Agarose fest geworden ist.
Folgen Sie dem Rand der Augenhöhle, verwenden Sie die Spitze einer feinen elektrolytisch geschärften Wolframnadel, um die Haut um das Auge zu stechen. Schieben Sie dann den Rand der Nadel unter dem Auge von der zeitlich-ventralen Seite des Auges. Verwenden Sie kontrollierten Druck, um das Auge aus der Augenhöhle zu lösen.
Drücken Sie das Auge dorsal und anterior mit der Seite der Nadel, schneiden Sie schließlich durch den Sehnerv und lassen Sie das Auge los. Alternativ können Sie sehr feine chirurgische Pinzetten verwenden, um das Auge zu entfernen, indem Sie den Sehnerv kneifen und das Auge von medial nach lateral drücken. Nach erfolgreicher Augenentfernung die Agarose mit MMR-Lösung bedecken, jede Larve von der Agarose befreien, indem Sie vorsichtig eine Wolframnadel um ihren Kopf und dann um ihren Körper bürsten, während Sie das Petrischalendeckel mit einer Pinzette stabilisieren.
Nach den Operationen legen Sie die Larve bis zum nächsten Tag in MMR-Lösung, die mit Antibiotika ergänzt wird, bringen Sie die Larve dann zu E3 zurück und ziehen Sie sie bis zum Endpunkt des Experiments auf. Nachdem die Larven unheilbar betäubt wurden, fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd. Hängen Sie die fixierten Larven in PBS-Tröpfchen auf einer Sealguard-Platte unter einem Seziermikroskop.
Sichern Sie sie seitlich, indem Sie zwei Wolframstifte durch das Notochord legen, wobei ein Stift posterior zu dem pigmentierten Bereich passt, der den AGM-Bereich bedeckt, und ein weiterer in Linie mit dem Ende der Dotterverlängerung. Entfernen Sie das Auge mit einer scharfen Wolframnadel und einer feinen Pinzette. Manchmal ist es möglich, die Nadel durch den Kiefer auf die gegenüberliegende Seite zu stechen und das andere Auge zu entfernen.
Verwenden Sie die Wolframnadel, um von der Schläfen- zur Bauchseite des Ohres zu kratzen. In der gleichen Aktion in Bewegung, bringen Sie die Nadel posterior zum Kiefer und ziehen Sie vorsichtig vorne, bis das Ohr und der Kiefer entfernt sind. Entfernen Sie das andere Auge und Ohr, indem Sie die Nadel durch den Kiefer stechen.
Verwenden Sie eine Pinzette, um die ventralen Organe und das verbleibende Eigelb herauszuziehen. Machen Sie schließlich einen flachen Schnitt in der dorsalen Schädelhaut in der Nähe der Verbindung zwischen dem Hinterhirn und dem Rückenmark. Heben Sie die Haut mit der Pinzette an und ziehen Sie sie anterior und um das Telencephalon herum.
Entfernen Sie das restliche Gewebe mit einer Pinzette. Lösen Sie die Larve und übertragen Sie sie auf PBS in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Sichern Sie einen Kammerschlitten in den Deckel einer 100 Millimeter Petrischale mit Vakuumfett.
Übertragen Sie die immungefärbte und verarbeitete Larve auf eine Brunnenplatte oder einen Vertiefungsobjektträger, um sie mit einem Seziermikroskop zu betrachten. Montieren Sie die Larve auf der Kammerrutsche in 1%LMP Agarosesäulen. Legen Sie mit einem Glas an Ihrer Pipette vorbei eine Larve auf die Kammerfolie und deponieren Sie so wenig PBS wie möglich.
Bedecken Sie die Larve mit geschmolzener und warmer 1% LMP-Agarose mit derselben Pipette. Pipette die LMP Agarose in eine Säule und positioniert die Larve dann möglichst symmetrisch mit sichtbarer Rückenoberfläche. Nach der Entfernung der Augen wurde eine fortschreitende Degeneration der retinalen Axone im optischen Tectum neuropil beobachtet.
Zwei Tage nach der Operation zeigten RFP-markierte Axone Merkmale einer schnellen Wallerschen Degeneration, wie Blabbing und Fragmentierung. RFP-positive Puncta wurden sowohl innerhalb als auch außerhalb des Neuropils auf der rechten Seite des Tektums festgestellt, wie durch die Pfeile angezeigt. Vier Tage nach der Operation waren fragmentierte Axone und RFP-markierte axonale Ablagerungen im rechten tektalen Lappen erheblich reduziert, was auf eine relativ schnelle Clearance der sterbenden und degenerierenden Axone hinweist.
Das Gehirn wurde durch Sezieren der Augen, des Kiefers, der Ohren und der Schädeldecke der Haut und des Bindegewebes freigelegt. Im Idealfall bleibt das Gehirn während dieses Eingriffs intakt. Teile des Vorderhirns, insbesondere der Riechkolben, wurden jedoch wahrscheinlich beschädigt oder vollständig entfernt, wenn die Schädeldecke der Haut oder des Kiefers entfernt wurde.
Darüber hinaus wird manchmal der seitliche Vorsprung des Tektums geschnitten, wenn die Haut durchbohrt oder eingeklemmt wird, um sie vom Gehirn zu ziehen. Keine zwei Proben sind identisch. Sie müssen also in der Lage sein, subtile Anpassungen durch die Entfernung von Augen und die Dissektion des Gehirns nach Bedarf vorzunehmen.
Patienten und scharfe Werkzeuge sind für den Erfolg unerlässlich. Diese Technik kann mit zellulären und molekularen Ansätzen wie in vivo Lebendzellbildgebung oder RNA-Sequenzierung fortgesetzt werden, um neue Einblicke in die molekularen und zellulären Mechanismen des optischen Tektumwachstums und der optischen Entwicklung zu gewinnen.
