We thank members of the UNC Zebrafish Aquaculture facility for maintenance of the zebrafish. We would also like to thank Diagnosys, LLC for assistance with the setup of the ERG apparatus. Additional thanks go to Dr. Portia McCoy and the laboratory of Dr. Ben Philpot for assistance with electrophysiological methods. We also wish to thank Lizzy Griffiths for her illustration of a larval zebrafish. This work was supported by National Institutes of Health awards F32 EY022279 (to J.D.C) and R21 EY019758 (to E.R.W).

Tier Pflege und experimentelle Protokolle wurden von den Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse der University of North Carolina in Chapel Hill genehmigt, und erfüllen alle Anforderungen der NIH Office of Laboratory Animal Welfare und der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung für Labortier Care International. HINWEIS: Um die Larven für ERG Analyse zu erhalten, veröffentlicht Protokolle für Standard Zebrafischhaltung und Wartung eingesetzt wurden 18. Larven werden durch natürliche Zucht erhalten und unter einem 14 Stunden Licht / 10 h Dunkel-Zyklus untergebracht. Dieses Protokoll wurde für die Larven in 5-7 Tage nach der Befruchtung (dpf) optimiert worden, konnte aber im Idealfall auf ältere Fische mit kleinen Änderungen an der Vorgehensweise durchgeführt werden. Hier verwenden Sie die TL-Stamm von Wildtyp-Zebrafisch-Larven bei 5 dpf. 1. Mikropipette Produktion <ol><li> Ziehen Sie mehrere Mikropipetten mit 1,5 x 0,86 mm (Außendurchmesser von Innendurchmesser) feuerpolierte Borosilikatglas Kapillaren mitFilament (Schmelztemperatur, 821 ° C) und eine P-97 Flaming / Braun Mikropipette Abzieher mit Feld Wärme Filament eingebaut. Verwenden Sie das Programm für die Gestaltung in Tabelle 1 beschriebenen Mikropipetten. </li><li> Überprüfen Sie jede Mikropipette unter dem Mikroskop mit einem geeigneten Raster Lineal, um sicherzustellen, dass Spitzen sind 10-15 um im Durchmesser und hat eine glatte Bahnöffnung (dh keine scharfen Kanten). </li><li> Sorgfältig zu verwahren Mikropipetten zur Spitze Schäden und die Belastung durch Staub zu verhindern. Speicheroptionen Petrischalen mit Labor-Band, mit Schaumstoff ausgekleideten Boxen, oder im Handel erhältliche Mikropipette Lagerbehälter. Hinweis: andere Mikropipette Abzieher und Glaskapillaren kann, solange die richtigen Durchmesser der Mikropipette und eine hochwertige Spitze erreicht wird. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Druck </td><td> Wärme </td><td> Ziehen </td><td> Geschwindigkeit </td&gt; <td> Zeit </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 560 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 450 </td><td> - </td><td> 30 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 410 </td><td> 55 </td><td> 40 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Programm für die Herstellung von Mikropipetten mit einem P-97 Flaming / braun Mikropipette Abzieher mit einem Kasten Wärme Filament eingebaut Mikropipetten werden mit 1,5 x 1,0 mm 2 (Außendurchmesser von Innendurchmesser) feuerpolierte Borosilikatglas Kapillaren mit Filament. (Schmelztemperatur 821 ° C). 2. Buffer Vorbereitung <ol><li> Gebrauch gefiltert, oxygenierte fish Ringer-Puffer 19 in der Mikroelektrode Kapillare und den Polyvinylalkohol (PVA) Schwamm, auf welche die Larven werden für Experimente platziert sättigen. Alternativ können Sie E3<html> Embryo Medien oder Hanks Balanced Salt Solution. </li><li> Bereiten Lösung 10x Goldfisch Ringer wie in Tabelle 2 beschrieben einstellen auf pH 7,8 und sterilisiert mit einem 0,22 um Filter und lagern Sie die 10-faches bei 4 ° C. </li><li> Erstellen Sie eine Arbeitslösung auf dem Tag des Experiments durch die 10x Ringerlösung verdünnt mit deionisiertem, destilliertem Wasser 1x. Filter mit einem 0,22 um Filter-System. Oxygenat durch Blasenbildung mit 95% O 2/5% CO &amp; sub2; -Gas für 10 Minuten. Deckel fest danach, um sicherzustellen, dass die Lösung bleibt oxygenierten. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> NaCl </td><td> 1,25 M </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 26 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mM </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; Tabelle 2: Herstellung einer Lösung 10x Goldfisch Ringer. 3. Elektroretinogramm Platform <ol><li> Führen ERG Experimente an einem Anti-Vibrationstisch in einem Faraday-Käfig, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern. Befestigen Sie eine benutzerdefinierte Stahlplattform mit dem Antivibrationstisch mit Sechskantmuttern. Legen Sie eine bewegliche Kunststoffplattform mit einem viskoelastischen Urethanpolymer stoßdämpfenden Boden auf den Tisch unter die Lichtquelle. </li><li> Positionieren Sie die Kamera mit einem magnetisierten stand, sich an den beweglichen Kunststoff-Plattform ab. Positionieren Sie den Mikromanipulator mit einem zweiten magnetisierten Stand auf der rechten Seite des beweglichen Kunststoff-Plattform (die die Aufzeichnungsmikro halten wird). Sicherzustellen, dass die Kamera und der Mikromanipulator wird nicht durch die Bewegung der anderen Geräte gestört werden und dass sie nicht die Beleuchtung von der Lichtquelle zu blockieren. </li><li> Schließen Sie die Kamera an einen Videomonitor und positionieren Sie es, um das Auge des sehenLarve für die Platzierung der Elektrode in der richtigen Position. </li><li> Stellen Sie sicher, dass das Setup richtig mit Kupferdraht geerdet. Um das Rauschen zu überprüfen, legen Sie die Referenzelektrode und die Spitze der Mikroelektrode in einer Aufnahme 35 mm Petrischale mit Ringer-Lösung gefüllt. Überprüfen Sie die elektrische Geräuschpegel des Setup mit einem Oszilloskop oder einem eingebauten Merkmal der ERG Gerät. Der Geräuschpegel sollte nicht mehr als ± 10 &amp; mgr; V von der Grundlinie sein. </li></ol> 4. Sponge Vorbereitung <ol><li> Schneiden Sie ein kleines Rechteck von trockenem PVA Schwamm, der fest in einer 35 mm Petrischale passt. Die Dicke des Schwammes sollte nicht größer als die Tiefe der Schale sein. Mit einem Messer mit einer sauberen Rasierklinge zum Schneiden. </li><li> Vereinbaren Sie einen zusätzlichen Schnitt in den Schwamm, um die Referenzelektrode unterzubringen (entweder ein flacher Schnitt der Länge nach auf den Boden der Schwamm oder ein Schmetterling vertikal durch eine der kleineren beschnitten). </li><li> Verwenden Sie einen chemisch beständigen Markierungum einen kleinen Punkt auf dem Schwamm (wo die Larve gelegt werden), die zur Positionierung der Kamera verwendet werden kann, zu markieren. </li><li> Weichen Sie die PVA Schwamm in Ringer-Lösung bis zur Sättigung. Entfernen und tupfen Sie schnell auf ein Papiertuch 2-3 mal. Setzen Sie den Schwamm in einer sauberen 35-mm-Petrischale. </li><li> Platzieren Sie die Petrischale mit dem Schwamm auf der Plastikplattform, so daß die Markierung von der Kamera sichtbar gemacht werden. </li></ol> 5. Elektrodenvorbereitung HINWEIS: Der Zebrafisch Aufbau besteht aus einer Referenzelektrode in Kontakt mit der Ringerlösung gesättigten PVA-Schwamm und einer Aufzeichnungselektrode, die in Kontakt mit der Hornhaut. Die Bezugselektrode besteht aus einer Ag / AgCl-Pellet. Die Aufzeichnungselektrode ist eine gezogene Glasmikropipette mit Ringer-Lösung gefüllt und durch ein Mikroelektrodenhalter, die eine Ag-Draht gehalten. <ol><li> Chlorid die Elektroden durch Einweichen in 6-9% Natriumhypochlorit (Bleiche) für 5 min (die Aufzeichnungs microelectrode Draht) oder 15 Minuten (die Referenzelektrode). Luft trocknen auf einem Kimwipe für 5 min. <ol><li> In Abhängigkeit von der Art der Schnitt in Schritt 4.2 gemacht, legen Sie die Ag / AgCl-Pellet der Referenzelektrode in die (für die vertikale Schmetterling ausschneiden) oder mit (für die flache Schnitt der Länge nach auf den Boden) dem Schwamm. Befestigen Sie die Referenzelektrode führen zu dem Aufzeichnungssystem. </li><li> Alternativ, wenn die ERG Setup hat Platz oder gibt es besonders starke Photovoltaik-Artefakten aus der Ag / AgCl-Elektrode, schließen Sie die Referenzelektrode mit dem Schwamm über ein Agar-Salzbrücke, die Elektrode aus dem Lichtweg zu bewegen. </li></ol></li><li> Bringen ~ 40 cm von geeigneter Größe Schlauch an einen 5 ml nicht-Luer-Lock-Spritze. Füllen Sie die Spritze mit Ringerlösung. Mikroelektrodenhalter besitzen Druckanschlüsse versenden in der Regel mit Adaptern für Schläuche mit Innendurchmessern von 1/16 unterzubringen &quot;, 3/32&quot;, 1/8 &quot;oder 5/32&quot;. </li><li> Füllen Sie eine 1 ml nicht-Luer-Lock-Spritze mitRinger-Lösung und mit einem Micro-fil, sorgfältig füllen die Mikroelektrodenhalter. Verhindern die Bildung von Blasen. </li><li> Befestigen Sie die 5-ml-Spritze mit dem Druckanschluss der Mikroelektrode Halter mit Schlauch und es verwenden, um sicherzustellen, dass die Mikroelektrodenhalter ist voll von Ringer-Lösung. Mit dem Micro-fil und 1-ml-Spritze mit Ringer-Lösung gefüllt, füllen Sie die Mikropipette Glas von der Spitze und sicherzustellen, dass keine Luftblasen vorhanden sind. </li><li> Befestigen Sie die Glas-Mikropipette auf die Mikroelektrodenhalter, wobei Sie darauf achten, den Elektrodendraht gerade zu halten. Sobald gesichert mit der 5 ml Spritze sorgfältig zwingen Ringerlösung durch die Mikroelektrode, bis eine kleine Menge der Lösung auf die Spitze sichtbar ist. Gelegentliche Anwendung von Druck auf die Spritze (wenn sie nicht an der Hornhaut angewendet wird) wird die Bildung von Luftblasen sowie Einschlüsse aufgrund von Staub oder Salzansammlung zu verhindern, in die Mikropipettenspitze. <ol><li> Wenn die Lösung herauskommt als ein Strom, ersetzen Sie die glass Mikropipette, die Spitzenöffnung zu groß ist oder beschädigt ist. </li></ol></li><li> Legen Sie das Aufnahme-Mikroelektrode im Mikromanipulator und befestigen Sie das Kabel mit dem Aufnahmesystem. </li></ol> 6. Elektroretinogramm Analyse HINWEIS: Aufgrund der Kegel Dominanz des Larvennetzhaut, können qualitativ hochwertige ERG Ergebnisse erhalten, wenn die Vorbereitungen für die Aufnahme unter niedrigen indirekten weißem Licht durchgeführt werden (&lt;1 Lux) oder für kurze Zeit (&lt;1 min) höherer Intensität ( ≤250 Lux) Arbeitslicht. Eine kurze Zeit der Dunkeladaptation ist weiterhin erforderlich, vor der Aufnahme (siehe Schritt 6.7). Jedoch können Versuche unter schwach rot oder Infrarotlicht unter Verwendung einer infrarotempfindlichen Kamera durchgeführt werden. Alle Experimente wurden in steril filtriert (0,22 um) System Wasser von der UNC Zebrafisch Aquakulturanlage durchgeführt, aber alternative Embryo Mittel können angewendet werden. <ol><li> Schneiden Sie Papiertuch Quadraten mit Abmessungen von ungefähr 1cm 2. </li><li> Wenn die Messung isoliert Kegel Masse receptor potential, Inkubation 3-5 Larven im System Wasser mit 500 uM (±) -2-Amino-4-phosphonobutyric Säure (APB) für 5 min. HINWEIS: Wenn APB ist eine racemische Mischung des aktiven (L) oder inaktiven (R) Formen AP4, ist es als L-AP4 als wirksame und weniger teuer. </li><li> Anesthetize 3-5 Larven im System Wasser mit 0,02% (w / v) Tricaine, bis nicht mehr reagiert, ca. 1-2 min. </li><li> Verwenden einer Pasteurpipette und Pipettenpumpe einzelne Larven vorsichtig Transfer auf Papiertuch Quadrate unter Sezieren Stereoskop mit minimalen Beleuchtungsstärke (Lux ≤250 &lt;1 min). Überprüfen Sie die Position der einzelnen Larve und wählen Sie einen Kandidaten, der Rückenseite mit einer nicht verschlossenen Auge ist. <ol><li> Für längere Aufnahmen (&gt; 30 min), feucht zu halten die Larve durch Verglasung der Körper bis zu aber nicht einschließlich der Kopf mit 3% Methylcellulose mit einem feinen Kamelhaarbürste. </li></ol></li><li> Mit einer Pinzette, übertragen Sie die Papiertuch square mit der Larve in die feuchten PVA Schwamm. <ol><li> Für längere Aufnahmen (&gt; 30 min), gelten ein kontinuierlicher Strom von wassergesättigter 100% O 2 -Gas über die Larve durch Einblasen des Gases durch eine Ausströmer in einem Seitenarm-Kolben, der destilliertes Wasser. Positionieren Sie den Schlauch Verlassen der Kolben Seitenarm, der die befeuchteten Sauerstoff in der Nähe von Kopf der Larve vermittelt. HINWEIS: Schritt 6.4.1 und Schritt 6.5.1 wird die Lebensdauer des Fisches 16 zu verlängern. </li></ol></li><li> Unter minimale Beleuchtung, verwenden Sie den Mikromanipulator und Kamera, um die Mikroelektrodenspitze in der Mitte zwischen der Nasen und Schwanzenden der Augenposition und drücken Sie vorsichtig auf die dorsale Grenze der Hornhaut. HINWEIS: Fehlanordnung der Elektrodenspitze in die entfernt distalen Bereichen der Hornhaut in ERG-Wellenformen mit umgekehrter Polarität führen. </li><li> Lassen Larve bis dunkel anpassen 5-10 min. </li><li> Nehmen Testblitz Reaktionen auf Licht von einer LED-Lichtquelle oder Licht Stimulator zur Verfügung gestellt mit dem avaiLabel Stimulation und Aufnahmegeräte. Passen Protokollparameter wie die Blitzintensität, Blitzweite, Blitzfarbe, Hintergrundintensität und Farb und Filtereinstellungen, um das Experiment zu passen. </li><li> Wenn das Experiment beendet ist, einschläfern Larven nach AVMA / IACUC Richtlinien. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

In diesem Protokoll ein einfaches Verfahren für die ERG-Aufnahmen von Larven Zebrafisch wird beschrieben. Dieses Verfahren ermöglicht eine schnelle und umfassende Test der visuellen function.There gibt mehrere wichtige Schritte im Rahmen des Verfahrens, das im Auge behalten werden sollte. Der Zebrafisch-Larven sollten gesund sein, bevor das Experiment zu Tode während der potenzielle medikamentöse Behandlungen zu vermeiden und eine längere Lebensunterhalt während der ERG-Aufnahmen. Darüber hinaus ist es wichtig, d...

Das Elektroretinogramm (ERG) ist eine nicht-invasive elektrophysiologischen Verfahren, die ausführlich in der Klinik für die Bestimmung der Funktion der Retina in Menschen verwendet wird. Die elektrische Aktivität in Reaktion auf einen Lichtreiz, wird durch Anordnen Aufzeichnungselektroden auf der äußeren Oberfläche der Hornhaut gemessen. Die Eigenschaften des Reizparadigma und der Antwort-Wellenform zu definieren, die retinalen Neuronen, die zur Reaktion. Dieses Verfahren ist für den Einsatz mit einer Reihe von Tiermodellen, einschließlich Mäusen und Zebrafisch angepasst. Die typische Wirbel ERG Antwort hat vier Hauptkomponenten: das a-Welle, die eine Hornhaut-negatives Potential von Photorezeptorzellaktivität abgeleitet ist; die b-Welle, eine Hornhaut-positives Potential von der ON bipolaren Zellen abgeleitet; der d-Welle, eine Hornhaut-positiven Potential wie die Aktivität der OFF bipolaren Zellen interpretiert; und die c-Welle, die nach der b-Welle einige Sekunden auftritt und spiegelt Aktivität in Müller Glia und retinal Pigmentepithel 1-4. Zusätzliche Hinweise für das Verständnis der Geschichte und Prinzipien der ERG Analyse bei Menschen und Modelltiere sind die Online-Lehrbuch, Webvision, von der University of Utah und Texte wie den Principles and Practice of Clinical Elektrophysiologie des Sehens 4, 5. Danio rerio (Zebrafisch) ist seit langem als Modell für die Entwicklung von Wirbeltieren begünstigt worden, aufgrund seiner schnellen Reifung und Transparenz, die für die nichtinvasive morphologische Analyse von Organsystemen, Verhaltens-Assays und sowohl vorwärts und rückwärts genetischen Screens (zur Übersicht siehe Fadool und ermöglicht Dowling 6). Zebrafisch-Larven sind sehr gut für genetische und pharmakologische Manipulation, die, wenn sie mit ihrer hohen Fruchtbarkeit, machen sie eine ausgezeichnete Tiermodell für die Hochdurchsatz-biologischen Analysen. Das höhere Verhältnis von Kegeln mit Stangen in Larven Zebrabärbling - etwa 1: 1 im Vergleich zu Mäusen (~ 3% Konuse) - machen sie besonders nützlich für die Untersuchung der Kegelfunktion 7-9. In der Retina von Wirbeltieren entwickeln Kegel vor Stangen 10. Interessanterweise sind Zebrafisch Kegel operative bereits 4 dpf, was eine selektive elektrophysiologische Analyse der Kegel in diesem Stadium 6, 11,12. Im Gegensatz dazu ERG-Antworten in Stäbe erscheinen zwischen 11 und 21 dpf 13. Daher Zebrafisch-Larven bei 4-7 dpf funktionell dienen als All-Kegel Netzhaut. Allerdings ist die Mutterphotopischen ERG Antwort von 4-7 dpf Larven von der b-Welle dominiert. Anwendung von pharmakologischen Mitteln, wie beispielsweise L - (+) - 2-Amino-4-phosphono-buttersäure (L-AP4), ein Agonist des metabotropen Glutamat (mGluR6) Rezeptors durch den, bezogen auf die bipolaren Zellen, blockiert wirksam die Erzeugung der b-Welle und zeigt die isolierte Kegel Masse receptor potential, (die &quot;a-Welle&quot;), 14-17. Hier beschreiben wir eine einfache und reliable Verfahren für ERG Analyse mit handelsüblichen ERG Geräte für den Einsatz mit Mäusen, die für die Verwendung mit Zebrafisch-Larven adaptiert wurden konzipiert. Dieses System kann auf Zebrafisch-Larven mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen, sowie diejenigen, mit pharmakologischen Mitteln behandelt, die Forscher bei der Identifizierung von Signalwegen, die visuelle Empfindlichkeit und leichte Anpassung 16 beitragen unterstützen genutzt werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Verfahren wird Ermittler im Gebrauch von ERG-Analyse, um eine Vielzahl von biologischen Fragen zu beantworten Vision führen und zeigen den Aufbau eines flexiblen ERG-Setup.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2170">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:333px;"><a name="RANGE!A1:D30">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:165px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1504px;">Comments/ Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Faraday cage</td>
			<td>80/20 Inc</td>
			<td>custom</td>
			<td>Custom designed aluminum &#34;Industrial Erector Set&#34; for Cage framework</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVA sponge</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B000ZOWG1C</td>
			<td>Provides a soft, moist platform for placement of zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">150 ml Sterile Filter systems</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431154</td>
			<td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Espion E2</td>
			<td>Diagnosys, LLC</td>
			<td>contact</td>
			<td>Modular electrophysiology system capable of generating visual stimuli for any stimulator and digital recording and analysis of responses using propietary software, more information at http://www.diagnosysllc.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Colordome</td>
			<td>Diagnosys, LLC</td>
			<td>contact</td>
			<td>Light stimulator with RGB LED and Xenon light sources for Ganzfeld ERG, more information at http://www.diagnosysllc.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micromanipulator</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-024-R</td>
			<td>Holding and positioning the recording microelectrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic ring stand</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-025-MB</td>
			<td>Holding and positioning of the camera and refrence electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lead extensions</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>F-LX</td>
			<td>Spare female to male 1.5 mm lead cables for connecting electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:333px;">Male Pin to Female SAFELEAD Adaptor</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>DF-215/10</td>
			<td>Connecting 2 mm pins to 1.5 headboard pins</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Window screen frame (metal) and spline</td>
			<td>Lowes or Home Depot</td>
			<td>various</td>
			<td>For attaching copper mesh to Faraday cage framework</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Steriflip 50 ml filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGP00525</td>
			<td>Filtering solutions to prevent small articulates from blocking micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BNC adaptor</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>4127</td>
			<td>Connecting camera to BNC cable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BNC cable</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>626</td>
			<td>Connecting camera to video adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera lens</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>1582232</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera coupler</td>
			<td>Navitar</td>
			<td>1501149</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luna BNC to VGA + HDMI Converter</td>
			<td>Sewell</td>
			<td>SW-29297-PRO</td>
			<td>BNC to VGA adaptor allowing camera image to project on computer monitor</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">APB</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1910</td>
			<td>mGluR6 agonist, blocks b-wave allowing analysis of the isolated cone mass receptor potential</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF-150-86-10</td>
			<td>Fire- polished borosilicate glass (metling temperature = 821&#176;C) with filament and dimensions of 1.5mm x 0.86 mm (outer diameter by inner diameter)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">P97 Flaming/Brown puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P97</td>
			<td>For pulling glass micropipettes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sorbothane sheet</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SB12A</td>
			<td>Synthetic viscoelastic urethane polymer, placed under Passive Isolation Mounts and ERG platform to absorb shock and prevent slipping, can be cut to size</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>B2436F</td>
			<td>Vibration isolation platfrom for ERG stimulator and zebrafish specimen</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Passive Isolation Mounts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PWA074</td>
			<td>Provides vibration isolation to breadboard</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper mesh</td>
			<td>TWP</td>
			<td>022X022C0150W36T</td>
			<td>To line Faraday Cage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td>Used with Pasteur pipettes to carefully transfer zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td>Used with Pipette pump to carefully transfer zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera</td>
			<td>Watec</td>
			<td>WAT-902B</td>
			<td>Visualizing the positioning of the recording microelectrode onto the larval cornea</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>Tricaine-S</td>
			<td>Pharmaceutical-grade anesthetic,</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-fil</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td>Filling microelectrode holder and microelectrode glass</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MEH2SW15</td>
			<td>Holds glass microelectrode, connects to ERG equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reference Electrode</td>
			<td>WPI</td>
			<td>DRIREF-5SH</td>
			<td>Carefully break off last centimeter of casing to drain electrolyte and expose sintered Ag/AgCl pellet electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reference Electrode (alternative)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Alternative to DRIREF-5SH. Ag/AgCl electrode that must be wired/soldered to connecting lead</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Low-noise cable for Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>13620</td>
			<td>Connecting recording microelctrode holder to adaptor/headboard</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroretinogram analysis of the visual response in zebrafish larvae

Das Elektroretinogramm (ERG) ist eine nicht-invasive elektrophysiologische Verfahren zur Bestimmung der Netzhautfunktion. Durch die Anordnung einer Elektrode auf der Oberfläche der Hornhaut, in Antwort auf Licht erzeugte elektrische Aktivität kann gemessen und verwendet, um die Aktivität von Netzhautzellen in vivo zu beurteilen. Diese Handschrift beschreibt die Verwendung von der ERG zur Sehfunktion im Zebrafisch zu messen. Zebrafische sind seit langem als Modell für die Entwicklung von Wirbeltieren wegen der Leichtigkeit der Gen-Unterdrückung durch Morpholino Oligonukleotiden und pharmakologische Manipulation genutzt. 5-10 dpf sind nur Zapfen Funktions im Larvennetzhaut. Daher ist die Zebrafisch, im Gegensatz zu anderen Tieren, ist ein leistungsfähiges Modellsystem für das Studium der Kegel visuellen Funktion in vivo. Dieses Protokoll verwendet Standard-Anästhesie, Mikromanipulation und Stereomikroskopie-Protokolle, die in Labors, die Zebrafisch-Forschung führen gemeinsam sind. Die beschriebenen Methoden verwenden Standard-Elektrophysiologie equipment und eine Lichtkamera, um die Platzierung der Aufnahme Mikroelektroden auf die Larvenhornhaut führen. Schließlich zeigen wir, wie ein handelsüblicher ERG Stimulator / Recorder ursprünglich für den Einsatz mit Mäusen entwickelt, kann leicht für die Verwendung mit Zebrafisch angepasst werden. ERG der Larven Zebrafisch ist eine ausgezeichnete Verfahren zur Untersuchung Kegel Sehfunktion bei Tieren, die von Morpholino Oligonukleotid Einspritzung geändert wurden, sowie neuere Genom-Engineering-Techniken wie beispielsweise Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs) Transkriptionsaktivator-Like Effektor Nukleasen (Talens) und Regelmäßig gruppierten beabstandeten Kurz Palindromic Repeats (CRISPR) / Cas9, alle haben die Effizienz und Wirksamkeit des Gen-Targeting in Zebrabärbling stark erhöht. Darüber hinaus nutzen wir die Fähigkeit von pharmakologischen Mitteln zur Zebrafisch-Larven, die molekularen Komponenten, die dem Photo beitragen bewerten zu durchdringen. Dieses Protokoll beschreibt eine Einrichtung, die geändert und von den Forschern verwendet werden könnenmit verschiedenen experimentellen Ziele.

Typischerweise werden ERGs von Zebrafisch-Larven bei 5 dpf erfasst, da eine Reihe von Studien haben ERG Aufnahmen in dieser Phase 9, 16,20 veröffentlicht. Larven Antworten wurden unter dunkeladaptierten Bedingungen ohne Hintergrundbeleuchtung mit einem 20 ms Reiz weißem LED-Licht gemessen. Wir verwendeten einen handelsüblichen ERG-System, bestehend aus einem Ganzfeld Licht Stimulator und Computer-Controller / Recorder. Der Stimulator verwendet ein proprietäres Pulsbreitenmodulation (PWM) System streng kon...

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Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Elektroretinogramm Analyse der Sicht Antwort in Zebrafisch-Larven

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.5K Aufrufe.  University of North Carolina at Chapel Hill. We present a method for the electroretinographic (ERG) analysis of zebrafish larvae utilizing micromanipulation and electroretinography techniques. This is a simple and straightforward method for assaying visual function of zebrafish larvae in vivo.

Serie: Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Forschung

Neurowissenschaften

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system measures spontaneous behaviors and the response to an aversive stimulus, which is shown to the larvae via a PowerPoint presentation. The recorded images are analyzed with an ImageJ macro, which automatically splits the color channels, subtracts the background, and applies a threshold to identify individual larvae placement in the lanes. We can then import the coordinates into an Excel sheet to quantify swim speed, preference for edge or side of the lane, resting behavior, thigmotaxis, distance between larvae, and avoidance behavior. Subtle changes in behavior are easily detected using our system, making it useful for behavioral analyses after exposure to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Our laboratory developed a novel high-throughput automated imaging system that is useful for the detection of several different behaviors in 7-day-old zebrafish larvae. The system can be used for detecting subtle changes in behavior after the larvae have been exposed to environmental toxicants or pharmaceuticals.

Automatisierte Hochdurchsatz-Analysen in Behavioral Zebrafischlarven

We have created a novel high-throughput imaging system for the analysis of behavior in 7-day-old zebrafish larvae in multi-lane plates. This system ...

The Optokinetic Response as a Quantitative Measure of Visual Acuity in Zebrafish

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple response. More recently adult visual behavior in zebrafish has become of interest, but methods to measure specific responses are new coming. To address this gap, we set out to develop a methodology to repeatedly and accurately utilize the optokinetic response (OKR) to measure visual acuity in adult zebrafish. Here we show that the adult zebrafish's visual acuity can be measured, including both binocular and monocular acuities. Because the fish is not harmed during the procedure, the visual acuity can be measured and compared over short or long periods of time. The visual acuity measurements described here can also be done quickly allowing for high throughput and for additional visual procedures if desired. This type of analysis is conducive to drug intervention studies or investigations of disease progression.

Zebrafish have been a valuable tool for many research areas. Here we demonstrate a method to elicit a visual response and calculate a functional visual acuity in the adult zebrafish.

Die optokinetischen Antwort als quantitatives Maß der Sehschärfe im Zebrafisch

Zebrafish are a proven model for vision research, however many of the  earlier methods generally focused on larval fish or demonstrated a simple  ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Gleichzeitig<em&gt; Ex vivo</em&gt; Funktionsprüfung von zwei Netzhäute von<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroretinogramm-System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablation von neuronalen Einwohner mit einem zwei-Photonen-Laser und ihre Bewertung mit Kalzium Imaging und Verhaltensstörungen Aufnahme in Zebrafischlarven

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using 128-channel high-density electroencephalography (EEG). The specific aim of the described stimuli and analyses is to examine whether it is feasible to replicate previously reported CVEP morphological patterns elicited by an apparent motion stimulus, designed to simultaneously stimulate both ventral and dorsal central visual networks, using object and motion stimuli designed to separately stimulate ventral and dorsal visual cortical networks.&#160; Four visual paradigms are presented: 1. Randomized visual objects with consistent temporal presentation. 2. Randomized visual objects with inconsistent temporal presentation (or jitter).&#160; 3. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion without jitter.&#160; 4. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion with jitter.&#160; These four paradigms are presented in a pseudo-randomized order for each participant.&#160; Jitter is introduced in order to view how possible anticipatory-related effects may affect the morphology of the object-onset and motion-onset CVEP response.&#160; EEG data analyses are described in detail, including steps of data exportation from and importation to signal processing platforms, bad channel identification&#160;and removal, artifact rejection, averaging, and categorization of average CVEP morphological pattern type based upon latency ranges of component peaks. Representative data show that the methodological approach is indeed sensitive in eliciting differential object-onset and motion-onset CVEP morphological patterns and may, therefore, be useful in addressing the larger research aim. Given the high temporal resolution of EEG and the possible application of high-density EEG in source localization analyses, this protocol is ideal for the investigation of distinct CVEP morphological patterns and the underlying neural mechanisms which generate these differential responses.&#160; &#160; &#160;&#160;

In this paper, we present a protocol to investigate differential cortical visual evoked potential morphological patterns through stimulation of ventral and dorsal networks using high-density EEG. Visual object and motion stimulus paradigms, with and without temporal jitter, are described. Visual evoked potential morphological analyses are also outlined.&#160;&#160;

Stimulusspezifische cortical Visual Evokierte potenzielle morphologische Muster

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...

Using Zebrafish Larvae to Study the Pathological Consequences of Hemorrhagic Stroke

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage (ICH). Modelling ICH pre-clinically has proven difficult, and current rodent models poorly recapitulate the spontaneous nature of human ICH. Therefore, there is an urgent requirement for alternative pre-clinical methodologies for study of disease mechanisms in ICH and for potential drug discovery.
The use of zebrafish represents an increasingly popular approach for translational research, primarily due to a number of advantages they possess over mammalian models of disease, including prolific reproduction rates and larval transparency allowing for live imaging. Other groups have established that zebrafish larvae can exhibit spontaneous ICH following genetic or chemical disruption of cerebrovascular development. The aim of this methodology is to utilize such models to study the pathological consequences of brain hemorrhage, in the context of pre-clinical ICH research. By using live imaging and motility assays, brain damage, neuroinflammation and locomotor function following ICH can be assessed and quantified.
This study shows that key pathological consequences of brain hemorrhage in humans are conserved in zebrafish larvae highlighting the model organism as a valuable in vivo&#160;system for pre-clinical investigation of ICH. The aim of this methodology is to enable the pre-clinical stroke community to employ the zebrafish larval model as an alternative complementary model system to rodents.

Here we present a protocol to quantify brain injury, locomotor deficits and neuroinflammation following bleeding in the brain in zebrafish larvae, in the context of human intracerebral hemorrhage (ICH).

Verwendung von Zebrafisch-Lamellen, um die pathologischen Folgen von hämorrhagischen Stroke zu studieren

Despite being the most severe subtype of stroke with high global mortality, there is no specific treatment for patients with intracerebral hemorrhage ...

Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional deficits. Numerous studies by our group and others have shown that mTBI stimulates cytokine expression and activates microglia, decreases cerebral blood flow and metabolism, and impairs cerebrovascular reactivity. Moreover, several works have reported an association between derangements in these neuroinflammatory and hemodynamic markers and cognitive impairments. Herein we detail methods to characterize the neuroinflammatory and hemodynamic tissue response to mTBI in mice. Specifically, we describe how to perform a weight-drop model of mTBI, how to longitudinally measure cerebral blood flow using a non-invasive optical technique called diffuse correlation spectroscopy, and how to perform a Luminex multiplexed immunoassay on brain tissue samples to quantify cytokines and immunomodulatory phospho-proteins (e.g., within the MAPK and NF&#954;B pathways) that respond to and regulate activity of microglia and other neural immune cells. Finally, we detail how to integrate these data using a multivariate systems analysis approach to understand the relationships between all of these variables. Understanding the relationships between these physiologic and molecular variables will ultimately enable us to identify mechanisms responsible for mTBI.

This protocol presents methods to characterize the neuroinflammatory and hemodynamic response to mild traumatic brain injury and to integrate these data as part of a multivariate systems analysis using partial least squares regression.

Systemanalyse der neuroinflammatorischen und hämodynamischen Reaktion auf traumatische Hirnverletzungen

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupille Zwei-Photonen-In-vivo-Bildgebung der Netzhaut der Maus

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...