Unser Protokoll liefert sowohl visuelle als auch Echtzeitinformationen darüber, wie der Prozess der Augenmorphogenese sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen abläuft. Unser Protokoll ermöglicht die schnelle Erfassung von Z-Stacks, wodurch die Zeit zwischen den einzelnen 3D-Bildern im Datensatz verringert wird. Dies bietet eine erhöhte zeitliche Auflösung der Art und Weise, wie die okuläre Morphogenese auftritt.
Die Positionierung des Embryos innerhalb der Kapillare kann aufgrund seiner sphärischen Form im Einzelsomitestadium eine Herausforderung darstellen, daher ist es wichtig, mehrere Embryonen in die Kapillare zu laden, um sicherzustellen, dass mindestens einer in der richtigen Ausrichtung ist. Um 10 Stunden nach der Befruchtung auf das Vorhandensein von Somiten zu untersuchen, legen Sie die Embryonen unter ein Stereomikroskop und verwenden Sie einen Fluoreszenzadapter, um das Vorhandensein des rx3:GFP-Transgens zu bestätigen. Sobald drei bis fünf GFP-positive einzelne Somit-Embryonen identifiziert wurden, verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Embryonen zu dekorieren.
Um die Embryonen in Agarose einzubetten, übertragen Sie die Embryonen in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 500 Mikroliter E3-Embryopuffer enthält, ergänzt um 168 Mikrogramm pro Milliliter Tricain, und geben Sie 500 Mikroliter gekühlte, aber flüssige 2% Agarose mit niedriger Schmelztemperatur und E3-Puffer mit sanftem Mischen in das Röhrchen. Verwenden Sie eine Ein-Millimeter-Glaskapillare mit einem PTFE-Kolben, um die in Agarose eingebetteten Embryonen in die Kapillare zu ziehen und die Agarose bei Raumtemperatur für 30 bis 60 Sekunden erstarren zu lassen. Legen Sie dann die Kapillare in ein Becherglas aus Tricain-ergänztem E3-Puffer.
Um ein Lichtblattmikroskop für die Embryonenbildgebung einzurichten, legen Sie die Kapillare in den Kapillarprobenhalter und klicken Sie auf die Metallscheide in der Mitte der Metallscheibe des Halters. Legen Sie zwei Gummistopfen in die Scheide, wobei die Schlitze den Enden der Scheide zugewandt sind, und schieben Sie die Kapillare durch die Mitte der Gummistopfen. Sobald sich der Marker an der Basis der Metallhülle befindet, verwenden Sie die Metallkappe, um die Kapillare an Ort und Stelle zu befestigen und den Halter mit den weißen Markierungen auf die Oberseite des Mikroskops zu legen.
Schließen Sie den Deckel des Probenhalters und klicken Sie auf die Schaltfläche Kapillare suchen in der Benutzeroberfläche der Mikroskopsoftware. Bewegen Sie die Kapillare über das Bedienfeld von Ergo Drive bis knapp über das Objektiv. Drücken Sie nach dem Öffnen des Deckels vorsichtig den Kolben, bis der Agaroseabschnitt, der den Embryo enthält, unter dem Kapillarboden vor dem Objektiv hängt.
Deaktivieren Sie Kapillar suchen und klicken Sie auf Probe suchen, um die Ansicht von der Probenkammer-Webcam auf das Mikroskopobjektiv umzuschalten und diese Ansicht zu verwenden, um die Position der Probe genauer einzustellen. Schalten Sie dann die Suchprobe aus und wechseln Sie zur Registerkarte Erfassung. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen z-stack und time series.
Wählen Sie im Fenster mit den Parametern des Erfassungsmodus die Einstellung für das beidseitige Lichtblatt aus, und aktivieren Sie die Kontrollkästchen für die duale Online-Fusion und das Pivot-Scannen. Klicken Sie auf kontinuierlich, um eine Live-Ansicht des Embryos zu erhalten. Wählen Sie im Fenster des Kanals 488 Kanal und stellen Sie die Laserleistung auf eins und die Belichtungszeit auf 7,5 Millisekunden ein.
Verwenden Sie das Bedienfeld von Ergo Drive, um die Position des Embryos anzupassen, bis das Augenfeld direkt zur Kamera zeigt, und passen Sie die linken und rechten Lichtblätter in den Kanalparametern an, bis das Augenfeld ausreichend scharf ist. Stellen Sie die erste und letzte Z-Position etwa 500 Mikrometer über das letzte detektierbare Fluoreszenzsignal hinaus ein und klicken Sie optimal, um die Schrittweite auf 0,477 Mikrometer einzustellen. Um die Inkubationsparameter einzustellen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen für die Peltier-Einheit, um die Temperatur bei 28 Grad Celsius zu halten.
Wählen Sie im Zeitreihenfenster die entsprechende experimentelle Frequenz und das Zeitintervall aus, um die Bilder zu erfassen. Klicken Sie auf Test starten. Wählen Sie den Ordner aus, in dem der Bildsatz gespeichert werden soll, und legen Sie das Bildpräfix fest, und klicken Sie dann auf Speichern, um das Imaging zu starten.
Importieren Sie für die Bildanalyse die Bilddateien in ein geeignetes 4D-Bildanalyse-Softwareprogramm und klicken Sie auf den 4D-Viewer-Würfel, die Maßstabsleiste und das Videosymbol, um die Storyboard-Taskleiste zu öffnen. Wählen Sie Keyframe-Sequenz hinzufügen und geben Sie die Dauer des Videos in Sekunden an. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Drehung erstellen und aktivieren Sie den Zeitverlauf verwenden, um bestimmte Zeitpunkte in das Video aufzunehmen.
Speichern Sie das Storyboard, um dieselben Parameter auf mehrere Bildsätze anzuwenden. Klicken Sie auf Film exportieren, um ein Video der Zeitrafferbildgebung zu speichern und die Filmexporteinstellungen anzugeben, einschließlich Dateiname und Speicherort, Videoformat, Videoauflösung, Bildrate und Datenauflösung. Fügen Sie bei Bedarf Zeitstempel hinzu und wählen Sie Datensatz aus.
Um Drehvideos zu bestimmten Zeitpunkten zu erstellen, fügen Sie wie gerade gezeigt eine Keyframe-Sequenz hinzu, aktivieren Sie jedoch das Kontrollkästchen Drehung erstellen und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Zeitfortschritt verwenden. Um ein hochauflösendes Bild in einer beliebigen Ausrichtung und zu einem beliebigen Zeitpunkt zu rendern, wählen Sie das Kamerasymbol im 4D-Viewer aus. Um eine Pipeline für die Analyse zu erstellen, wählen Sie Kolben, um auf das Analysefenster zuzugreifen, und öffnen Sie das Menü Analysevorgänge, um die Reihenfolge der gewünschten Vorgänge auszuwählen.
Klicken Sie auf das blaue Dreieck, um die Pipeline zu starten. Klicken Sie am Ende des Laufs im Popupfenster auf Featurespalten, um eine Liste der Features anzuzeigen, die Informationen über das Objekt von Interesse bereitstellen können, und klicken Sie dann auf Exportieren, um die Daten in eine Tabelle zu exportieren. In dieser repräsentativen Analyse wurde ein transgener rx3:GFP-Embryo alle fünf Minuten vom einen Somite-Stadium bis 24 Stunden nach der Befruchtung für insgesamt 14 Stunden vom dorsalen Standpunkt aus abgebildet.
Wie beobachtet, erleichterte die Durchführung eines Pipeline-Laufs der aus dieser Analyse aufgenommenen Bilder die Erzeugung einer Maske des sich entwickelnden Auges. Beachten Sie, dass, wenn das Augenfeld in zwei optische Vesikel getrennt wird, eine dritte rx3: GFP-positive Region im Vorderhirn beobachtet werden kann, die zum Hypothalamus beigetragen hat. Diese Information wurde auch in den Volumendaten beobachtet und kann leicht von den optischen Vesikeldaten getrennt werden, da sie im Volumen viel kleiner war als das für beide optischen Vesikel beobachtete.
Diesem Verfahren können zusätzliche Analysen folgen, z. B. die Verfolgung einzelner Zellen im gesamten Bilddatensatz.
