Mit diesem Protokoll kann jedes Labor, das über ein Standard-Konfokalmikroskop verfügt, das mit einem 405-Nanometer-Laser ausgestattet ist, Laserablationen für Haarzellen-Vorläufer durchführen und deren Regeneration überwachen. Im Gegensatz zur Elektroablation begrenzt diese Technik Schäden an umgebenden Zellen und ist zugänglicher als ein leistungsstarkes gepulstes UV-Laser-Setup. Konfokale Bildgebung kann auch unmittelbar vor und nach der Ablation durchgeführt werden.
Diese Technik ermöglicht es uns, das regenerative Verhalten von sensorischen Vorläufern besser zu verstehen, was bei der Entwicklung von Therapien für menschlichen Hörverlust helfen kann. Zur Montage der ersten Pipette drei bis vier Beästhesienlarven in ein kleines Tröpfchen E3-Tricain-Lösung in die Mitte der 35-Millimeter-Schale, mit einer 14-Millimeter-Zahl 1,5 Abdeckung Slip-Boden. Entfernen Sie die überschüssige Lösung, so dass die Larven in einem kleinen Tröpfchen bleiben, das gerade groß genug ist, um sie einzudämmen.
Und legen Sie die Schale auf die Bühne eines binokularen Stereomikroskops. Manipulieren Sie den Zoom und Fokus, so dass sich alle Larven im Sichtfeld befinden, und verwenden Sie eine Transferpipette, um dem Deckblatt eine dünne Schicht Agro-Lösung hinzuzufügen. Entfernen Sie die überschüssigen Agros, bis die Flüssigkeit nur den Brunnen an der Unterseite der Schale füllt, wobei darauf geachtet wird, keine Larven zu aspirieren.
Und verwenden Sie ein Haarmesser, um die Larven in der Agro-Lösung schnell mit der rostralen Seite nach links zu orientieren. Drücken Sie die Larven vorsichtig gegen das Glas, so dass die Larven im Profil liegen und ihre rechten Seiten nach unten. Nach etwa 60 Sekunden beginnen sich die Agros zu erstarren und die Larven können nicht neu ausgerichtet werden.
Nach fünf Minuten verwenden Sie eine Transferpipette, um die Schale auf halbem Weg mit E3 zu füllen, ergänzt mit 1X Tricaine. Um prospektive Ziele zu lokalisieren, schalten Sie die Leistung des konfokalen Mikroskopiesystems für Laserscans ein und initialisieren Sie den Laser über die integrierte Bildgebungssoftware. Wählen Sie das 63X Plan-Apochromat Öl Immersion Objektiv und tragen Sie Tauchöl auf die Linse auf.
Sichern Sie die Schale in einem kreisförmigen Bühneneinsatz mit dem rostralen Aspekt der Larven nach links. Wählen Sie mit der Beleuchtung von hellen Feld- oder Differentialinterferenzenkontrasten eine der montierten Larven für die Bildgebung aus und verwenden Sie den Fokusknopf, um die Haut an der Seite des Fisches, die der Abdeckung am nächsten liegt, in den Fokus zu rücken. Wechseln Sie zur epifluoreszenten Beleuchtung im GFP-Kanal und lokalisieren Sie die hintere Seitenlinie durch GFP-Expression entlang des horizontalen Myoseptums.
Ringe von fluoreszierenden Zellen sind bezeichnend für die Neuromast-Mantelzellen und längsierte Zellstränge sind die interneuromast-Zellen. Beginnend mit dem ersten migrierenden Primordium-Neuromast, verwenden Sie den Stage Control Joystick, um visuell kauarisch entlang des horizontalen Myoseptums zu scannen. Nach der Reihe der interneuromasten Zellen, bis die Region zwischen dem dritten und vierten wandernden Primordium Neuromasten erreicht ist.
Wenn mehrere Larven abgebildet werden sollen, wählen Sie die Position aus, um die erste Schrittposition festzulegen. Nachdem Zellkörper im L3-Bereich identifiziert wurden, wechseln Sie in den Erfassungsmodus und verwenden Sie einen geeigneten Laser, um die GFP-Bildabbildspur zu aktivieren. Um der aktivierten Laserspur einen Durchlichtkanal hinzuzufügen, klicken Sie im Dropdown-Menü Imaging Setup auf das T-PMT-Feld.
Um ET20-Larven abzubilden, wählen Sie den 488-Nanometer-Laser, stellen Sie die Laserleistung auf 6% der Lochgröße auf eine Flächeneinheit äquivalent und die digitale Verstärkung auf 750. Passen Sie die Gewinne so an, dass die Zellkörper gesättigt sind, um ansonsten düstere Projektionen und Filopodia zu erfassen. Und stellen Sie die Framegröße auf 1, 024 x 1, 024 Pixel, die Mittelung auf zwei und der digitale Zoom auf 0,7.
Aktivieren Sie das Feld Z-Stack, um das Dropdown-Menü Z-Position aufzurufen. Während des schnellen Scannens konzentrieren Sie sich, bis die interneuromast-Zellen gerade aus dem Fokus sind und stellen Sie das erste Slice ein. Konzentrieren Sie sich durch die Probe, bis die interneuromast-Zellen wieder aus dem Fokus sind und setzen Sie die letzte Scheibe.
Klicken Sie dann auf Stopp und klicken Sie auf Experiment starten, um einen Z-Stapel vor der Ablation zu erfassen. Wenn die Stufenpositionen hinzugefügt wurden, deaktivieren Sie die Positionsoption, damit nur die aktuelle Position abgestellt wird, und speichern Sie die Datei, sobald sie erfasst wurde. Für die Laserablation der Zielkörper klicken Sie auf Alle Werkzeuge in der Erfassungsschnittstelle anzeigen und wählen Sie im Menü Imaging-Setup eine neue Spur hinzufügen aus.
Klicken Sie auf Färben, und wählen Sie DAPI aus. Wählen Sie unter Kanäle 405 für die Lasereinstellung aus und erhöhen Sie die Laserleistung auf 75 %, klicken Sie auf den DAPI-Kanal, um den Laser auszuschalten, während Sie nach Kandidatenzellenkörpern für die Ablation suchen. Klicken Sie live und mit dem Körper einer interneuromast Zelle im Sichtfeld zentriert, zoomen Sie in den Scan-Frame auf 20 bis 22X.
Beenden Sie das Live-Scannen, sobald der Zellkörper das Sichtfeld ausfüllt. Überprüfen Sie die 405 Nanometer Laser-Shutter-Box, um die Spur zu aktivieren und einen Timer für 45 Sekunden einzustellen. Aktivieren Sie dann das kontinuierliche Scannen und starten Sie den Timer.
Sofortiges Beenden des Scannens nach 45 Sekunden. Für die Abbildung der Zellkörper nach der Ablation, unter dem Menü Kanäle, deaktivieren Sie die DAPI-Spur, um den Ablationslaser zu deaktivieren und öffnen Sie das Erfassungsmodus-Menü. Klicken Sie auf Zoom enumgand, und verringern Sie den Zoom auf 0,7.
Um den Erfolg der Zellablation zu bewerten, scannen Sie schnell das Sichtfeld. Mit den gleichen Einstellungen wie für die Pre-Ablation-Bildgebung, erfassen und speichern Sie ein Bild nach der Ablation. Prüfen Sie das Bild des durchserückenden Lichts photomultiplier Rohrkanals, um den Zellschaden weiter zu bestätigen.
Beschädigte Zellen zeigen ein körniges Aussehen und die Kerne schwellen häufig an oder erscheinen unregelmäßig in der Form. Um die Wiederherstellung des Zellkörpers nach der Ablation zu bewerten, aktivieren Sie sowohl die Bühnenpositions- als auch die Zeitoptionen für die Zeitraffer-Bildaufnahme und legen Sie die Zeitparameter auf den entsprechenden experimentellen Zeitpunkt und 15-Minuten-Intervalle fest. Starten Sie dann das Experiment, um Bilder zu erfassen, und speichern Sie die resultierende Datei, wenn sie abgeschlossen ist.
In diesem repräsentativen Experiment wurde der Bereich der Seitlichen Linie zwischen dem dritten und vierten wandernden Primordium-Neuromast identifiziert und Vorablationsbilder erfasst. Nach der Überprüfung des Abscanvorgangs wurde bestätigt, dass keine Zellkörper in der abkatadierten Region verblieben sind. Eine Lücke zwischen den langgestreckten Projektionen der angrenzenden interneuromast-Zellen hinterlassen.
Die Analyse des durchseliegenden Photomultiplier-Rohrkanals nach ablation zeigt beschädigte und absterbende Zellen. Gekennzeichnet durch geschwollene und unregelmäßig geformte Kerne und ein körniges Aussehen. Die Rekrutierung von großen Amoebodenzellen, die wahrscheinlich Makrophagen sind, kann auch beobachtet werden.
In diesem Experiment erzeugte die Ablation mehrerer Zellen in den doppeltransgenen Larven große Lücken in der Interneuromastzellen-Zeichenfolge, hatte aber kaum oder gar keine Wirkung auf den Lateralliniennerv. Nach der Laserablation können Spaltgrößen gemessen werden. Von wenigen Mikrometern bis zu 100 Mikrometern, abhängig von der Breite, die die einzelnen Neuromastzellen haben und wie viele Zellen für die Ablation ausgewählt werden.
Nach der Ablation erholen sich einige Interneurmastzellen innerhalb der ersten Stunden der Bildgebung. Mit der Wahrscheinlichkeit eines Lückenschlusses, der negativ mit der Lückengröße korreliert. Selbst in interneuromasten Zellen, die sich nicht erholen können, kann jedoch die Bildung langer Projektionen aus benachbarten interneuromast-Zellen beobachtet werden, die sich ausweitenden neuronalen Wachstumskegeln ähneln können.
Es ist wichtig, den T-PMT-Kanal gründlich auf beschädigte Zellen mit unregelmäßig geformten Kernen und Granularität zu untersuchen und genügend Zeit zu lassen, damit diese Indikatoren des Zelltodes sichtbar werden. Eine weitere Analyse der resultierenden Zeitraffer-Mikroskopiedaten kann möglicherweise neuartige zelluläre Verhaltensweisen aufdecken, die durch Laserablation induziert werden, und kann die Entwicklung von Experimenten zur Identifizierung von Regulierern der Regeneration leiten. Diese Technik hat es uns ermöglicht, die molekularen Regulatoren der Interneuromastzellregeneration zu untersuchen, indem wir eine schnelle und kostengünstige Methode zur selektiven Schädigung dieser Zellen anbieten.
