Die Glukoseaufnahme ist der Schlüssel zum Verständnis von Gesundheit und Krankheit. Denn Glukose spielt eine entscheidende Rolle bei metabolischen und strukturellen Anforderungen im menschlichen Körper sowie eine wichtige Rolle bei der Regulierung. Die extrazelluläre Messung von Glukose ermöglicht die Entwicklung von Hochdurchsatz-Assays für die Kinetik der Glukoseaufnahme in Zellen, Geweben und Organen unterschiedlicher genetischer Herkunft als Reaktion auf Nährstoffe oder Medikamente.
Dieser Assay wäre ein wertvolles Werkzeug für die Entdeckung von Therapeutika und Ernährung für Diabetes, Krebs, degenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems, Fettleibigkeit und alle Erkrankungen der Glukose und des Stoffwechsels. Der Assay benötigt eine Anpassung der Zeit für Hunger und Stimulation, die auf metabolischen Besonderheiten für verschiedene Gewebe und Zellkulturen basieren sollte. Kultur von 3T3-L1-Mausfibroblasten durch Plattieren von 10 bis 6 Zellen, verdünnt in 20 Milliliter Medium 1 in 296 Well-Platten.
Platte 100 Mikroliter Zellsuspension pro Vertiefung, um die Homogenität dieser Suspension durch Mischen zu erhalten. Züchten Sie Zellen für 48 Stunden in einem 37-Grad-Inkubator ohne Medienwechsel bis etwa 70 bis 80% Konfluenz. Halten Sie die Zellen konfluent und nüchtern, indem Sie sie 48 Stunden lang im selben Medium kultivieren.
Variieren Sie die Inkubationszeit von 24 bis 72 Stunden, abhängig vom gewünschten katabolen Fastenzustand. Dekantieren Sie Medien aus Zellen in den 96 Well-Platten. Nehmen Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern auf.
Spülen Sie die 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern PBS pro Vertiefung ab und nehmen Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern auf. Fügen Sie 100 Mikroliter glukosefreies DMEM pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie für 40 Minuten. Passen Sie die Inkubationszeit in Abhängigkeit von den Reizen des Zelltyps und dem gewünschten Fastenniveau an.
Verwenden Sie acht Replikate für jede Simulationsbedingung. Bereiten Sie daher für jede Simulationsbedingung einen Milliliter vor. Verwenden Sie sieben Simulationsbedingungen ohne Insulin.
FD-Glukose von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter, 1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,5 Mikrogramm pro Milliliter, 0,2 Mikrogramm pro Milliliter, 0,1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,05 Mikrogramm pro Milliliter und 0 Milligramm pro Milliliter in 196-Well-Platte. Verwenden Sie sieben Stimulationsbedingungen mit Insulin. FD-Glucose von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter, 1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,5 Mikrogramm pro Milliliter, 0,2 Mikrogramm pro Milliliter, 0,1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,05 Mikrogramm pro Milliliter und 0 Mikrogramm pro Milliliter in einer weiteren 96-Well-Platte.
Um die Stimulationsbedingungen vorzubereiten, verdünnen Sie einen Mikroliter von fünf Milligramm pro Milliliter FD-Glucose-Arbeitslösung und 999 Mikroliter glukosefreies DMEM, um einen Milliliter Arbeitsstammlösung zu erhalten. Unter Verwendung dieser Arbeitsmateriallösung werden 1 bis 2000, 1 bis 5.000, 1 bis 10.000, 1 bis 25.000, 1 bis 50.000 und 1 bis 100.000 Wahnvorstellungen von FD-Glucose hergestellt, um 2,5 Mikrogramm pro Milliliter, 1 Mikrogramm pro Milliliter, 0,5 Mikrogramm pro Milliliter, 0,2 Mikrogramm pro Milliliter, 0,1 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten, 0,05 Mikrogramm pro Milliliter in zwei Milliliterröhrchen unmittelbar vor Experimenten in einer Biosicherheitswerkbank ohne Licht. Fügen Sie zu jeder dieser Bedingungen einen Mikroliter Insulin hinzu.
Nach 40 Minuten Inkubation dekantieren Sie das glukosefreie DMEM aus jeder Vertiefung in 96 Well-Platten und absorbieren Sie die restliche Flüssigkeit mit sterilen Papiertüchern. Fügen Sie jeweils 100 Mikroliter aus den verschiedenen zuvor beschriebenen Behandlungsbedingungen in Vertiefungen entlang einer Säule hinzu. Und 100 Mikroliter aus dem gleichen Behandlungszustand zu den Vertiefungen entlang der Reihe in beiden 96 Wandplatten.
Beschriften Sie die Platten, die die Bedingungen verwendeten, mit und ohne Insulin. Fügen Sie glukosefreies DMEM allein in die Kontrollmulden hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 40 Minuten im Zellkulturinkubator im Dunkeln.
Nachdem die Zellen für 40 Minuten stimuliert wurden. Übertragen Sie die Stimulationsmedien von beiden Platten in neue 96-Well-Platten unter Beibehaltung des gleichen experimentellen Layouts. Waschen Sie die Zellen mit PBS.
Entfernen Sie PBS und dekantieren Sie die restliche Lösung auf sterilen Papiertüchern. Fügen Sie dem Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer einen Proteaseinhibitor hinzu, um Proteine zu schützen. Legen Sie Platten mit Radioimmunpräzipitationstest für 30 Minuten in einen Shaker.
Messen Sie mit einem Mikrotiterplatten-Reader die Fluoreszenz bei Anregungs- und Emissionswellenlängen bei 485 bzw. 535 Nanometern. Zuerst in dem Medium, das extrazelluläre FD-Glukose enthält, und dann die Platte mit Radioimmunpräzipitationstest lisierte Zellen am Ende der 30-minütigen Inkubation. Führen Sie den BCA-Proteintest gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
Quantifizierung der Proteinkonzentrationen in jeder Vertiefung, die Radioimmunpräzipitationstests enthält. Verwenden Sie 10 Mikroliter des Radio-Immunpräzipitationsassays Homogenat und messen Sie Proteinkonzentrationen und verdreifachen Sie, um die Genauigkeit der Messungen in 96 Well-Platten zu erhöhen. Quantifizieren Sie das Protein basierend auf Proteinstandards, die zusammen mit Proben auf jeder 96-Well-Platte analysiert werden.
Inkubieren Sie das entnommene Gewebe oder die Organe eine Minute lang in einer Platte mit sechs Vertiefungen, die PBS enthält. Behandeln Sie jedes Gewebe oder Organ in einem separaten Brunnen. Nach einer Minute legen Sie jedes Taschentuch auf ein steriles Papiertuch, um PBS zu absorbieren.
Übertragen Sie Gewebe oder Organe in eine separate sechswandige Platte mit 4.000 Mikrolitern glukosefreiem DMEM und inkubieren Sie zwei Minuten lang. Nach zwei Minuten das Gewebe entfernen und in Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit 0,29 Millimolar FD-Glukose-Arbeitslösung überführen. Inkubieren Sie die sechs Well-Platten, die Gewebe enthalten, in FD-Glukose-Arbeitslösung bei 37 Grad Celsius.
Sammeln Sie 100 Mikroliter FD-Glukose-Arbeitslösung aus jeder Vertiefung nach 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 und 120 Minuten Inkubation und übertragen Sie gesammelte 100 Mikroliter FD-Glukose-Arbeitslösung in 96 Well-Platten, um die Kinetik der extrazellulären FD-Glukoseverarmung zu analysieren. Vor und nach der Sammlung schütteln. Messen Sie die Fluoreszenz bei Anregung in Emissionswellenlängen bei 485 bzw. 535 Nanometer mit einem Mikroplattenleser.
Die Dosisabhängigkeit bei der intrazellulären Aufnahme von FD-Glukose war in Gegenwart von Insulin signifikant erhöht. Die Insulinstimulation führte zu signifikant verringerten extrazellulären FD-Glukosespiegeln im Vergleich zu den Proben ohne Insulinstimulation. Die extrazelluläre Erschöpfung von FD-Glukose kann eine Änderung der Glukoseaufnahme mit vergleichbarer Genauigkeit messen wie die intrazelluläre FD-Glukoseaufnahme.
Die extrazelluläre FD-Glukose war während der 120-minütigen Inkubation nicht in nicht stimuliertem viszeralem Kontrollfett erschöpft. Im Gegensatz dazu führte die Vorbehandlung von Mäusen mit Insulin oder AAC2 vor der Dissektion zu einer signifikanten Erschöpfung der extrazellulären FD-Glukose innerhalb eines Zeitintervalls von 30 Minuten bzw. 60 Minuten. Extrazelluläre FD-Glukose war in insulinstimulierten Leberexplantaten im Vergleich zu nicht stimulierten Leberexplantaten nicht erschöpft.
Extrazelluläre FD-Glukose war zeitabhängig signifikant erniedrigt, und Leberexplantate, die mit AAC2,22% vorbehandelt wurden, wurde im extrazellulären Medium, das das nicht behandelte Gehirn enthielt, nach 60 Minuten Inkubation beobachtet. Das Medium, das mit Gehirnen von insulinbehandelten Mäusen inkubiert wurde, zeigte eine lineare Abnahme der FD-Glukose um 5%. AAC2-stimulierte Gehirne führten zu einem tiefgreifenden schnellen Abfall auf 67,4% der extrazellulären FD-Glukose während der ersten 20 Minuten.
Substanzen, die gewaschen werden, sind besonders wichtig, um Spuren von Glukose, Blut oder Serum im Medium und/oder in Organen zu entfernen, da sie die Fluoreszenzmessung dieser Medien stören können. Nach Hochdurchsatz konnten Verbindungen von Metaboliten in Genen mit glykämischen Eigenschaften sowie die optimalen Bedingungen für ihre Wirkung in vivo Experimente mit markierter FD-Glukose und PET-Scanning validiert werden, um die Glukoseakkumulation in bestimmten Organen zu bestätigen. Diese Technik zur Entdeckung der glykämischen Wirkung ist sowohl vorteilhaft bei der Deletion zahlreicher Metaboliten, Therapeutika oder deren Kombinationen als auch bei der Hervorhebung ihrer Wirkungen in verschiedenen Organen.
