포도당 섭취는 건강과 질병을 이해하는 열쇠입니다. 포도당은 인체의 대사 및 구조적 요구에 중추적인 역할을 할 뿐만 아니라 조절에 중요한 역할을 합니다. 포도당의 세포외 측정은 영양소 또는 약물에 반응하여 다양한 유전적 배경을 가진 세포, 조직 및 기관에서 포도당 흡수의 동역학을 위한 고처리량 분석의 개발을 가능하게 합니다.
이 분석은 당뇨병, 암, 중추 신경계의 퇴행성 질환, 비만 및 포도당 및 신진 대사의 모든 질병에 대한 치료제 및 영양 발견을위한 귀중한 도구가 될 것입니다. 분석은 다양한 조직 및 세포 배양에 대한 대사 특성을 기반으로 해야 하는 기아 및 자극 시간 조정이 필요합니다. 배양 3T3-L1 마우스 섬유아세포를 6 세포에 10 밀리리터로 플레이팅하여, 배지 1의 20 밀리리터를 296 웰 플레이트에 희석하였다.
웰당 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 플레이트화하고, 혼합함으로써 이 현탁액의 균질성을 유지하도록 한다. 약 70-80 % confluency까지 배지를 변경하지 않고 섭씨 37도 인큐베이터에서 48 시간 동안 세포를 성장시킵니다. 세포를 합류 상태로 유지하고 48시간 동안 동일한 배지에서 배양하여 금식합니다.
배양 시간은 원하는 공복 이화 작용 상태에 따라 24 시간에서 72 시간까지 다양합니다. 96 웰 플레이트의 세포로부터 디캔트 배지. 멸균 된 종이 타월을 사용하여 남은 액체를 흡수하십시오.
96웰 플레이트를 웰당 100마이크로리터의 PBS로 헹구고 멸균 종이 타월로 남은 유체를 흡수합니다. 웰당 100마이크로리터의 무포도당 DMEM을 첨가하고, 40분 동안 배양한다. 세포 유형 자극 및 원하는 금식 수준에 따라 배양 시간을 조정하십시오.
각 시뮬레이션 조건에 대해 8번의 반복실험을 사용합니다. 따라서 각 시뮬레이션 조건에 대해 1 밀리리터를 준비하십시오. 인슐린 없이 7가지 시뮬레이션 조건을 사용합니다.
196 웰 플레이트에서 밀리리터당 2.5 마이크로그램, 밀리리터당 1 마이크로그램, 밀리리터당 0.5 마이크로그램, 밀리리터당 0.2 마이크로그램, 밀리리터당 0.1 마이크로그램, 밀리리터당 0.05 마이크로그램, 및 밀리리터당 0 밀리그램의 FD 포도당. 인슐린과 함께 7 가지 자극 조건을 사용하십시오. 다른 96 웰 플레이트에서 밀리리터당 2.5 마이크로그램, 밀리리터당 1 마이크로그램, 밀리리터당 0.5 마이크로그램, 밀리리터당 0.2 마이크로그램, 밀리리터당 0.1 마이크로그램, 밀리리터당 0.05 마이크로그램, 및 밀리리터당 0 마이크로그램의 FD 포도당.
자극 조건을 준비하기 위해 1 밀리리터 FD 포도당 작업 용액 당 5 밀리그램의 1 마이크로 리터와 999 마이크로 리터의 포도당이없는 DMEM을 희석하여 1 밀리리터의 작업 저장 용액을 얻습니다. 이 작업 스톡 용액을 사용하여 FD 포도당의 1 내지 2000, 1 내지 5, 000, 1 내지 10, 000, 1 내지 25, 000, 1 내지 50, 000 및 1 내지 100, 000 망상을 준비하여 밀리리터당 2.5 마이크로그램, 밀리리터당 1 마이크로그램, 밀리리터당 0.5 마이크로그램, 밀리리터당 0.2 마이크로그램, 밀리리터당 0.1 마이크로그램, 조명이없는 생물 안전 캐비닛에서 실험 직전에 2 밀리리터 튜브에 밀리리터 당 0.05 마이크로 그램. 이러한 각 조건에 1 마이크로 리터의 인슐린을 추가하십시오.
인큐베이션 40분 후, 각 웰로부터의 글루코스 유리 DMEM을 96웰 플레이트에서 디캔트하고, 나머지 유체를 멸균 페이퍼 타월로 흡수한다. 앞에서 설명한 다양한 처리 조건에서 각각 100 마이크로리터를 하나의 컬럼을 따라 웰에 추가합니다. 및 100 마이크로리터를 동일한 처리 조건에서 웰을 따라 행으로 96개의 벽판으로 한다.
인슐린이 있거나없는 조건을 활용 한 플레이트에 라벨을 붙입니다. 포도당이 없는 DMEM 단독으로 대조군 웰에 추가합니다. 플레이트를 어두운 곳에서 세포 배양 인큐베이터에서 40분 동안 배양합니다.
세포가 40 분 동안 자극 된 후. 두 플레이트의 자극 매체를 새로운 96웰 플레이트로 옮기고 동일한 실험 레이아웃을 유지합니다. PBS로 세포를 세척하십시오.
PBS를 제거하고 멸균 종이 타월에 남은 용액을 디캔트합니다. 단백질을 보호하기 위해 전파 면역침전 분석 완충액에 프로테아제 억제제를 추가합니다. 전파 면역 침전 분석이 포함 된 플레이트를 셰이커에 30 분 동안 놓습니다.
마이크로플레이트 리더를 사용하여 여기 및 방출 파장에서 각각 485 및 535나노미터에서 형광을 측정합니다. 먼저 세포외 FD 글루코스를 함유하는 배지에서, 플레이트를 방사면역침전 분석법으로 30분 배양 종료시에 세포를 lized하였다. 제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 분석을 수행합니다.
방사성 면역침전 분석을 포함하는 각 웰 내의 단백질 농도를 정량화한다. 10 마이크로리터의 전파 면역침전 분석 균질액을 사용하고, 단백질 농도를 측정하고, 96 웰 플레이트에서 측정의 정확도를 높이기 위해 삼중으로 하였다. 각 96웰 플레이트의 샘플과 함께 분석된 단백질 표준물질을 기반으로 단백질을 정량화합니다.
수확된 조직 또는 기관을 PBS를 함유하는 6웰 플레이트에서 1분 동안 배양한다. 각 조직이나 기관을 별도의 우물에서 다루십시오. 1 분 후, PBS를 흡수하기 위해 멸균 된 종이 타월에 각 티슈를 놓습니다.
조직 또는 기관을 4, 000 마이크로리터의 글루코스 유리 DMEM을 함유하는 별도의 6개의 벽 플레이트에 옮기고, 2분 동안 배양한다. 2분 후, 조직을 제거하고 0.29 밀리몰 FD 글루코스 작업 용액을 함유하는 6웰 플레이트의 웰로 옮긴다. 조직을 함유하는 6개의 웰 플레이트를 섭씨 37도의 FD 글루코스 작업 용액에서 배양한다.
0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 및 120분의 배양 후 각 웰로부터 100마이크로리터의 FD 포도당 작업 용액을 수집하고 수집된 100마이크로리터의 FD 포도당 작업 용액을 96웰 플레이트로 옮겨 세포외 FD 포도당 고갈의 동역학을 분석합니다. 수집 전후에 흔들어주십시오. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각각 485 및 535 나노미터에서 방출 파장의 여기 시 형광을 측정합니다.
FD 포도당의 세포 내 흡수에서의 용량 의존성은 인슐린의 존재 하에서 상당히 증가되었다. 인슐린 자극은 인슐린 자극이없는 샘플에 비해 세포 외 FD 포도당 수준을 현저히 감소시켰다. FD 포도당의 세포외 고갈은 세포내 FD 포도당 흡수와 유사한 정확도로 포도당 흡수의 변화를 측정할 수 있습니다.
세포외 FD 글루코스는 인큐베이션 120분 동안 비자극된 대조군 내장 지방에서 고갈되지 않았다. 대조적으로, 해부 전에 인슐린 또는 AAC2로 마우스를 전처리한 결과, 각각 30분 및 60분의 시간 간격 내에 세포외 FD 포도당이 현저히 고갈되었다. 세포외 FD 포도당은 인슐린 자극된 간 외식편에서 고갈되지 않았으며, 비자극된 간 외식편과 비교하였다.
세포 외 FD 포도당은 시간 의존적 방식으로 현저히 감소했으며, AAC2.22 %로 전처리 된 간 체외 이식편은 배양 60 분 후 비 처리 뇌를 포함하는 세포 외 배지에서 포도당 고갈이 관찰되었다. 인슐린 처리 마우스의 뇌와 함께 배양 된 배지는 FD 포도당의 5 % 선형 감소를 보였다. AAC2 자극 뇌는 처음 20 분 동안 세포 외 FD 포도당의 67.4 %로 급격히 감소했습니다.
세척과 관련된 물질은 배지 및 기관 내에서 미량의 포도당, 혈액 또는 혈청을 제거하는 데 특히 중요한데, 이는 이러한 매질의 형광 판독을 방해할 수 있기 때문입니다. 혈당 특성을 가진 유전자에서 대사 산물 화합물의 높은 처리량 식별 후 생체 내 실험을위한 최적의 조건을 표지 된 FD 포도당 및 PET 스캐닝으로 검증하여 특정 기관에서 포도당 축적을 확인할 수있었습니다. 혈당 작용의 발견을위한이 기술은 수많은 대사 산물, 치료제 또는 그 조합의 결실에 유익하며 다른 기관에서의 작용을 강조합니다.
