Unser Labor untersucht metabolische Veränderungen in der Netzhaut und im gesamten zentralen Nervensystem, die mit dem Alter sowie bei neurodegenerativen Erkrankungen auftreten. Unser übergeordnetes Ziel ist es, diese Erkenntnisse zu nutzen, um neue therapeutische Ziele für die Behandlung altersbedingter neurodegenerativer Erkrankungen zu identifizieren. Der Nachweis der Glukoseaufnahme im Netzhautgewebe ist oft teuer und zeitaufwändig und erfordert komplizierte Bildgebungsverfahren oder sogar radioaktive Substanzen.
Wir haben dieses Protokoll entwickelt, um eine neuartige ex vivo-Technik zur Messung der Aufnahme von fluoreszierenden Glukoseanaloga in Netzhautproben bereitzustellen. Das von uns entwickelte Protokoll bietet eine unkomplizierte und kostengünstige Strategie zur Messung der Ex-vivo-Aufnahme von fluoreszierenden Glukoseanaloga in die gesamte intakte Netzhaut. Diese Methode ist auch insofern von Vorteil, als sie es den Forschern ermöglicht, mehrere Proben gleichzeitig zu messen.
Dieses Protokoll wird es den Forschern ermöglichen, Veränderungen in der retinalen Aufnahme von fluoreszierenden Glukoseanaloga zu bewerten, was uns helfen wird, besser zu verstehen, wie die Netzhaut Glukose als energetisches Substrat sowohl mit zunehmendem Alter als auch in gesunden und kranken Zuständen nutzt. Zu Beginn wird eine Stammlösung von fünf Millimolaren 6-NBDG in einer Mischung aus 50 % DMSO und PBS hergestellt. 500 Mikroliter Aliquots der Lösung bei minus 20 Grad Celsius lagern.
Legen Sie ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit Neurobasal-A Medium ohne Glukose auf Eis. Etikettieren Sie 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen als Glukosemangel, 6-NBDG-Inkubation, Ultraschall und Probenentnahme für den Pierce-Assay. Geben Sie 100 Mikroliter gekühltes Neurobasal-A-Medium in die vormarkierten Beschallungsröhrchen auf Eis.
Schalten Sie das Plattenlesegerät ein. Richten Sie die Plattenparameter in der Plattenlesesoftware mit der Fluoreszenz-Endpunkt-Assay-Funktion ein, wobei die Anregung auf 483 Nanometer, die Emission auf 550 Nanometer und der Cutoff-Wert auf 530 Nanometer eingestellt ist. Verdünnen Sie die fünf Millimolare Stammlösung von sechs NBDG in Neurobasal-A-Medien, um eine 500 Mikromolare Arbeitslösung herzustellen, und decken Sie sie mit Aluminiumfolie ab, um sie vor Licht zu schützen.
Pipettieren Sie 200 Mikroliter der Arbeitslösung in die vorbeschrifteten 6-NBDG-Inkubationsröhrchen und decken Sie sie wie gezeigt ab. Nachdem Sie die Netzhaut von einer euthanasierten Maus mit einer getrimmten Transferpipette oder Pinzette isoliert haben, übertragen Sie die Netzhaut in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 200 Mikrolitern Neurobasal-A-Medium für Glukosemangel. Inkubieren Sie das Röhrchen 20 Minuten lang in einem 37 Grad heißen Wasserbad.
Übertragen Sie die Netzhaut in ein vormarkiertes Röhrchen mit 200 Mikrolitern 500 mikromolaren 6-NBDG in Neurobasal-A Medium. Inkubieren Sie das Röhrchen 60 Minuten lang in einem 37 Grad heißen Wasserbad. Zur Herstellung von 6-NBDG-Standards beschriften Sie acht 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen als Standards eins bis acht.
Pipettieren Sie für die Standardlösung 32 Mikroliter 500 mikromolare 6-NBDG-Stammlösung in das markierte Röhrchen. Geben Sie dann 368 Mikroliter Neurobasal-A Medium in das Röhrchen und mischen Sie es gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren. Decken Sie alle Tuben mit Alufolie ab.
Nach der 60-minütigen 6-NBDG-Inkubation nehmen Sie die Röhrchen aus dem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Um die Netzhaut zu waschen, entfernen Sie die 6-NBDG-Lösung mit einer Pipette, ohne das Netzhautgewebe zu stören, und geben Sie 500 Mikroliter frisches, eiskaltes Neurobasal-A Medium auf Eis. Anschließend wird die Netzhaut mit einer Pinzette vorsichtig in die Ultraschallröhren mit Neurobasal-A-Medium auf Eis übertragen.
Schneide die Netzhaut mit einer kleinen Präparierschere in kleine Stücke. Beschallen Sie jede Netzhaut fünf bis 10 Sekunden lang mit einer Amplitude von 10 und legen Sie die Röhre sofort wieder auf Eis. Die Proben werden bei 21.130 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.
Übertragen Sie 100 Mikroliter Überstand in eine 96-Well-Platte. Setzen Sie die Platte in den Tellerleser ein. Wählen Sie den Fluoreszenz-Endpunkt-Assay mit den angegebenen Wellenlängen aus.
Führen Sie den Assay aus und speichern Sie die Ergebnisse. Pipettieren Sie die Proben nach dem Lauf von der 96-Well-Platte in vormarkierte Röhrchen für den Pierce-Assay. Geben Sie unter Verwendung der vorverdünnten Pierce-Assay-Proteinstandards 10 Mikroliter jedes Standards in doppelter Ausführung in eine durchsichtige 96-Well-Bodenplatte.
Übertragen Sie dann 10 Mikroliter Probe in die Platte. Geben Sie 150 Mikroliter Pierce-Reagenz in alle Vertiefungen, die Standards oder Proben enthalten. Den Teller abdecken und auf einem Plattenschüttler bei mittlerer Geschwindigkeit eine Minute lang mixen.
Inkubieren Sie die Platte fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Setzen Sie die Platte in den Plattenleser ein und wählen Sie den Absorptionsendpunkt-Assay mit einer Wellenlänge von 660 Nanometern aus. Messen Sie die Absorption der Standards und Proben, speichern Sie die Ergebnisse und zeichnen Sie eine Standardkurve, um das Gesamtmikrogramm-Protein in jeder Probe zu bestimmen.
Glukosefluoreszenzmessungen zeigten eine Zunahme der 6-NBDG-Aufnahme in der Netzhaut von Wildtyp-Mäusen nach 30 Minuten Inkubation, die nach 60 Minuten ihren Höhepunkt erreichte, gefolgt von einer Abnahme der willkürlichen Einheiten nach 90 Minuten. Die Zugabe des GLUT1-Inhibitors, bay 876, reduzierte die 6-NBDG-Aufnahme um 24%, was auf die Beteiligung von GLUT1-unabhängigen Mechanismen in der Wildtyp-Mausretina hinweist.
