Glikoz alımı, sağlığı ve hastalığı anlamanın anahtarıdır. Glikoz, insan vücudundaki metabolik ve yapısal taleplerde çok önemli bir rol oynadığından, aynı zamanda düzenlemede hayati bir rol oynamaktadır. Glikozun hücre dışı ölçümü, besin maddelerine veya ilaçlara yanıt olarak farklı genetik geçmişe sahip hücrelerde, dokularda ve organlarda glikoz alımının kinetiği için yüksek verimli testlerin geliştirilmesine izin verir.
Bu tahlil, diyabet, kanser, merkezi sinir sisteminin dejeneratif hastalıkları, obezite ve tüm glikoz ve metabolizma hastalıkları için terapötiklerin ve beslenmenin keşfi için değerli bir araç olacaktır. Tahlil, farklı dokular ve hücre kültürleri için metabolik özelliklere dayanması gereken açlık ve stimülasyon için zamanın ayarlanmasına ihtiyaç duyar. Kültür 3T3-L1 fare fibroblastları, 10'u 6 hücreye kaplayarak 296 kuyu plakasında 20 mililitre orta 1'de seyreltilir.
Plaka kuyu başına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu, bu süspansiyonun homojenliğini karıştırmak suretiyle korunmasını sağlar. 37 santigrat derecelik bir inkübatörde 48 saat boyunca hücreleri, yaklaşık% 70 ila% 80 akıcıya kadar ortam değiştirmeden büyütün. Hücreleri 48 saat boyunca aynı ortamda kültürleyerek akıcı ve oruç tutun.
İstenilen açlık katabolik durumuna bağlı olarak kuluçka süresini 24 ila 72 saat arasında değiştirin. 96 kuyu plakasındaki hücrelerden gelen dekant ortam. Steril kağıt havlular kullanarak kalan sıvıyı emer.
96 kuyucuklu plakayı kuyu başına 100 mikrolitre PBS ile durulayın ve kalan sıvıyı steril kağıt havlularla emer. Kuyu başına 100 mikrolitre glikozsuz DMEM ekleyin ve 40 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka süresini hücre tipi uyaranlara ve istenen açlık seviyesine bağlı olarak ayarlayın.
Her simülasyon koşulu için sekiz çoğaltma kullanın. Bu nedenle, her simülasyon koşulu için bir mililitre hazırlayın. İnsülin olmadan yedi simülasyon koşulu kullanın.
FD glikoz mililitre başına 2.5 mikrogram, mililitre başına 1 mikrogram, mililitre başına 0.5 mikrogram, mililitre başına 0.2 mikrogram, mililitre başına 0.1 mikrogram, mililitre başına 0.05 mikrogram ve 196 kuyu plakasında mililitre başına 0 miligram. İnsülin ile yedi stimülasyon koşulu kullanın. FD glikozu mililitre başına 2.5 mikrogram, mililitre başına 1 mikrogram, mililitre başına 0.5 mikrogram, mililitre başına 0.2 mikrogram, mililitre başına 0.1 mikrogram, mililitre başına 0.05 mikrogram ve başka bir 96 kuyu plakasında mililitre başına 0 mikrogramdır.
Stimülasyon koşullarını hazırlamak için, mililitre FD glikoz çalışma çözeltisi başına bir mikrolitre beş miligram ve bir mililitre çalışma stoğu çözeltisi elde etmek için 999 mikrolitre glikozsuz DMEM seyreltin. Bu çalışma stoğu çözeltisini kullanarak, mililitre başına 2.5 mikrogram, mililitre başına 1 mikrogram, mililitre başına 0.5 mikrogram, mililitre başına 0.5 mikrogram, mililitre başına 0.5 mikrogram, mililitre başına 0.2 mikrogram, mililitre başına 0.1 mikrogram, mililitre başına 0.1 mikrogram, mililitre başına 0.2 mikrogram, mililitre başına 0.1 mikrogram elde etmek için 1 ila 25, 000, 1 ila 25, 000, 1 ila 50, 000 ve 1 ila 100.000 FD glikoz sanrısı hazırlayın. Işıksız bir biyogüvenlik kabininde yapılan deneylerden hemen önce iki mililitrelik tüplerde mililitre başına 0.05 mikrogram. Bu koşulların her birine bir mikrolitre insülin ekleyin.
40 dakikalık inkübasyondan sonra, glikozsuz DMEM'yi 96 kuyucuk plakasında her bir kuyucuktan boşaltın ve kalan sıvıyı steril kağıt havlularla emer. Daha önce açıklanan çeşitli tedavi koşullarından her biri 100 mikrolitreyi, bir sütun boyunca kuyucuklara ekleyin. Ve aynı işlem koşulundan 100 mikrolitre, her iki 96 duvar plakasındaki sıra boyunca kuyucuklara.
Koşulları kullanan plakaları, insülinli ve insülinsiz olarak etiketleyin. Kontrol kuyularına tek başına glikozsuz DMEM ekleyin. Plakayı karanlıkta hücre kültürü inkübatöründe 40 dakika boyunca inkübe edin.
Hücreler 40 dakika boyunca uyarıldıktan sonra. Stimülasyon ortamını her iki plakadan yeni 96 kuyu plakasına aktarın ve aynı deneysel düzeni koruyun. Hücreleri PBS ile yıkayın.
PBS'yi çıkarın ve steril kağıt havluların üzerinde kalan solüsyonu boşaltın. Proteinleri korumak için radyo immünopresipitasyon testi tamponuna bir proteaz inhibitörü ekleyin. Radyo immünopresipitasyon testi içeren plakaları 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.
Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, uyarılmada floresan ve sırasıyla 485 ve 535 nanometrede emisyon dalga boylarını ölçün. İlk önce hücre dışı FD glikoz içeren ortamda, daha sonra radyoimmünopresipitasyon tahlili plaka, 30 dakikalık inkübasyonun sonunda hücreleri lize etti. BCA protein testini üreticinin talimatlarına göre yapın.
Radyo immünopresipitasyon tahlili lize edilmiş hücreler içeren her kuyucuktaki protein konsantrasyonlarını sayısallaştırın. 10 mikrolitre radyo immünopresipitasyon testi homojenatı kullanın ve protein konsantrasyonlarını ölçün ve 96 kuyu plakasındaki ölçümlerin doğruluğunu artırmak için üçe katlayın. Her 96 kuyu plakasındaki örneklerle birlikte analiz edilen protein standartlarına göre proteini sayısallaştırın.
Hasat edilen dokuları veya organları PBS içeren altı kuyucuklu bir plakada bir dakika boyunca inkübe edin. Her doku veya organı ayrı bir kuyuda tutun. Bir dakika sonra, PBS'yi emmek için her bir mendili steril bir kağıt havluya yerleştirin.
Dokuları veya organları 4.000 mikrolitre glikozsuz DMEM içeren ayrı bir altı duvar plakasına aktarın ve iki dakika boyunca inkübe edin. İki dakika sonra, dokuları çıkarın ve 0.29 Milimolar FD glikoz çalışma çözeltisi içeren altı kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. FD glikoz çalışma çözeltisindeki dokuları içeren altı kuyucuk plakasını 37 santigrat derecede inkübe edin.
0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 dakikalık inkübasyondan sonra her kuyucuktan 100 mikrolitre FD glikoz çalışma çözeltisi toplayın ve toplanan 100 mikrolitre FD glikoz çalışma çözeltisini, hücre dışı FD glikoz tükenmesinin kinetiğini analiz etmek için 96 kuyucuk plakasına aktarın. Toplamadan önce ve sonra sallayın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak sırasıyla 485 ve 535 nanometrede emisyon dalga boylarında uyarma sırasında floresanı ölçün.
İnsülin varlığında FD glukozun hücre içi alımında doz bağımlılığı anlamlı olarak artmıştır. İnsülin stimülasyonu, insülin stimülasyonu olmayan örneklere kıyasla hücre dışı FD glukoz düzeylerinin önemli ölçüde azalmasına neden oldu. FD glukozun hücre dışı tükenmesi, glikoz alımındaki bir değişikliği, hücre içi FD glikoz alımı ile karşılaştırılabilir doğrulukla ölçebilir.
Hücre dışı FD glukoz, 120 dakikalık inkübasyon sırasında uyarılmamış kontrol viseral yağında tükenmedi. Buna karşılık, diseksiyondan önce farelerin insülin veya AAC2 ile ön muamelesi, sırasıyla 30 dakika ve 60 dakikalık bir zaman aralığında hücre dışı FD glikozunun önemli ölçüde tükenmesine yol açmıştır. İnsülin ile uyarılmış karaciğer eksplantlarında hücre dışı FD glukoz, uyarılmamış karaciğer eksplantlarına kıyasla tükenmemiştir.
Hücre dışı FD glukozu zamana bağlı olarak anlamlı derecede azaldı ve AAC2.22% ile önceden muamele edilmiş karaciğer eksplantları, 60 dakikalık inkübasyondan sonra tedavi edilmemiş beyni içeren hücre dışı ortamda glikozun tükenmesi gözlendi. İnsülin ile tedavi edilen farelerden beyinlerle inkübe edilen ortam, FD glikozunda% 5'lik doğrusal bir düşüş göstermiştir. AAC2 ile uyarılmış beyinler, ilk 20 dakika boyunca hücre dışı FD glikozunun% 67.4'üne kadar derin bir hızlı düşüşe yol açtı.
Yıkama içeren madde, ortam ve veya organlardaki glikoz, kan veya serum izlerini gidermek için özellikle önemlidir, çünkü bu ortamların floresan okumasına müdahale edebilir. Glisemik özelliklere sahip genlerdeki metabolit bileşiklerinin yüksek verimle tanımlanmasından ve in vivo deneylerdeki eylemleri için en uygun koşullardan sonra, belirli organlarda glikoz birikimini doğrulamak için etiketli FD glikoz ve PET taraması ile doğrulanabilir. Glisemik etkinin keşfi için bu teknik, hem çok sayıda metabolitin, terapötiklerin veya bunların kombinasyonlarının silinmesinde faydalıdır hem de farklı organlardaki etkilerini vurgular.
