A captação de glicose é a chave para entender a saúde e a doença. Como a glicose desempenha um papel fundamental nas demandas metabólicas e estruturais no corpo humano, além de desempenhar um papel vital na regulação. A medição extracelular da glicose permite o desenvolvimento de ensaios de alto rendimento para cinéticas de absorção de glicose em células, tecidos e órgãos de diferentes origens genéticas em resposta a nutrientes ou drogas.
Este ensaio seria uma ferramenta valiosa para a descoberta de terapêutica e nutrição para diabetes, câncer, doenças degenerativas do sistema nervoso central, obesidade e todas as doenças da glicose e metabolismo. O ensaio precisa de um ajuste de tempo para fome e estimulação que deve ser baseado em especificidades metabólicas para diferentes tecidos e culturas celulares. Fibroblastos de camundongos 3T3-L1 por revestimento de 10 a 6 células, diluídos em 20 mililitros de média 1 em 296 placas de poço.
Placa 100 microliters de suspensão celular por poço, garantindo manter a homogeneidade desta suspensão misturando. Cultivar células por 48 horas em uma incubadora Celsius de 37 graus sem mudar a mídia até cerca de 70 a 80% de confluência. Mantenha as células confluentes e jejuadas, culminando-as no mesmo meio por 48 horas.
Varie o tempo de incubação de 24 a 72 horas, dependendo do estado catabólico de jejum desejado. Mídia decantada de células nas 96 placas do poço. Absorva o fluido restante usando toalhas de papel estéreis.
Enxágüe a placa de 96 poços com 100 microliters de PBS por poço, e absorva o fluido restante com toalhas de papel estéreis. Adicione 100 microliters de DMEM livre de glicose por poço e incubar por 40 minutos. Ajuste o tempo de incubação dependendo dos estímulos do tipo celular e do nível desejado de jejum.
Use oito réplicas para cada condição de simulação. Portanto, prepare um mililitro para cada condição de simulação. Use sete condições de simulação sem insulina.
Glicose FD de 2,5 microgramas por mililitro, 1 micrograma por mililitro, 0,5 micrograma por mililitro, 0,2 micrograma por mililitro, 0,1 micrograma por mililitro, 0,05 microgramas por mililitro e 0 miligrama por mililitro em placa de 196. Use sete condições de estimulação com insulina. Glicose FD de 2,5 microgramas por mililitro, 1 micrograma por mililitro, 0,5 micrograma por mililitro, 0,2 micrograma por mililitro, 0,1 micrograma por mililitro, 0,05 microgramas por mililitro e 0 micrograma por mililitro em outra placa de poço de 96.
Para preparar as condições de estimulação, diluir um microlitr de cinco miligramas por solução de trabalho de glicose FD mililitro, e 999 microliters de DMEM livre de glicose para obter um mililitro de solução de estoque de trabalho. Usando esta solução de estoque de trabalho, prepare de 1 a 2000, 1 a 5.000, 1 a 10.000, 1 a 25.000, 1 a 50.000, e 1 a 100.000 delírios de glicose FD para obter 2,5 microgramas por mililitro, 1 micrograma per mililitro, 0,5 micrograma por mililitro, 0,2 micrograma por mililitro, 0,05 microgramas por mililitro em dois tubos mililitros imediatamente antes de experimentos em um armário de biossegurança sem luzes. Adicione um microliter de insulina a cada uma dessas condições.
Após 40 minutos de incubação, decante o DMEM livre de glicose de cada poço em 96 placas de poço, e absorva o fluido restante com toalhas de papel estéreis. Adicione 100 microliters cada um das várias condições de tratamento descritas anteriormente, a poços ao longo de uma coluna. E 100 microliters da mesma condição de tratamento para os poços ao longo da linha em ambas as 96 placas de parede.
Rotule as placas que utilizaram as condições, com e sem insulina. Adicione dMEM sem glicose sozinho aos poços de controle. Incubar a placa por 40 minutos na incubadora de cultura celular no escuro.
Depois que as células foram estimuladas por 40 minutos. Transfira a mídia de estimulação de ambas as placas para novas placas de poço 96, mantendo o mesmo layout experimental. Lave as células com PBS.
Remova o PBS e decante qualquer solução restante em toalhas de papel estéreis. Adicione um inibidor de protease ao tampão de ensaio de imunoprecipitação de rádio para proteger as proteínas. Coloque placas contendo ensaio de imunoprecipitação por rádio em um agitador por 30 minutos.
Usando um leitor de microplaca, meça fluorescência em comprimentos de onda de excitação e emissão a 485 e 535 nanômetros, respectivamente. Primeiro no meio contendo glicose FD extracelular, e depois a placa com radioimunoprecipitação ensaio células lized no final de 30 minutos de incubação. Realize o ensaio de proteína BCA de acordo com as instruções do fabricante.
Quantifique as concentrações proteicas em cada poço contendo radioiprecipitação as células lized. Use 10 microliters do ensaio de imunoprecipitação de rádio homogeneizar, e medir concentrações proteicas, e triplicar para aumentar a precisão das medições em 96 placas de poço. Quantifique a proteína com base nos padrões proteicos analisados em conjunto com amostras em cada placa de poço de 96.
Incubar os tecidos ou órgãos colhidos em uma placa de seis poços contendo PBS por um minuto. Manuseie cada tecido ou órgão em um poço separado. Após um minuto, coloque cada tecido em uma toalha de papel estéril para absorver PBS.
Transfira tecidos ou órgãos em uma placa de parede separada contendo 4.000 microliters de DMEM sem glicose e incubar por dois minutos. Após dois minutos, remova e transfira os tecidos para poços de uma placa de seis poços contendo solução de trabalho de glicose 0,29 Millimolar FD. Incubar as seis placas de poço contendo tecidos na solução de trabalho de glicose FD a 37 graus Celsius.
Colete 100 microliters de solução de trabalho de glicose FD de cada poço após 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 e 120 minutos de incubação, e transfira coletou 100 microliters de solução de glicose FD em 96 placas de poço para analisar a cinética do esgotamento de glicose extracelular FD. Agite antes e depois da coleta. Meça a fluorescência na excitação em comprimentos de onda de emissão em 485 e 535 nanômetros, respectivamente usando um leitor de microplaca.
A dependência de dose na absorção intracelular da glicose FD foi significativamente aumentada na presença de insulina. A estimulação da insulina levou a uma diminuição significativa dos níveis extracelulares de glicose FD em comparação com as amostras sem estimulação de insulina. O esgotamento extracelular da glicose FD pode medir uma mudança na absorção de glicose com precisão comparável como absorção intracelular de glicose FD.
A glicose fd extracelular não foi esgotada em gordura visceral de controle não estimulada durante 120 minutos de incubação. Em contraste, o pré-tratamento de camundongos com insulina ou AAC2 antes da dissecção, levou a um esgotamento significativo da glicose FD extracelular dentro de um intervalo de tempo de 30 minutos e 60 minutos, respectivamente. A glicose FD extracelular não foi esgotada em explants hepáticas estimuladas pela insulina, em comparação com explants hepáticas não estimuladas.
A glicose FD extracelular foi significativamente diminuída na forma dependente do tempo, e as explanagens hepáticas pré-tratadas com esgotamento de AAC2,22% de glicose foram observadas no meio extracelular contendo o cérebro não tratado após 60 minutos de incubação. O meio incubado com cérebros de camundongos tratados com insulina tem mostrado uma diminuição 5% linear na glicose FD. Os cérebros estimulados a AAC2 levaram a uma profunda diminuição rápida para 67,4% da glicose fd extracelular durante os primeiros 20 minutos.
A substância que envolve a lavagem é especialmente importante para remover vestígios de glicose, sangue ou soro dentro do meio e, ou órgãos, pois pode interferir na leitura da fluorescência desses meios. Após a identificação de alto rendimento de compostos de metabólitos em genes com propriedades glicêmicas, bem como as condições ideais para seus experimentos in vivo de ação, poderia ser validada com glicose FD rotulada e escaneamento PET para confirmar o acúmulo de glicose em órgãos específicos. Esta técnica de descoberta de ação glicêmica é benéfica tanto na exclusão de inúmeros metabólitos, terapêuticas ou suas combinações, e destaca suas ações em diferentes órgãos.
