Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es Ihnen ermöglicht, Immunhistochemie am Notum von Drosophila pupa durchzuführen, auch nachdem sie zuvor verwundet und live abgebildet wurden, ohne die Architektur des Gewebes zu stören. Diese Technik ermöglicht es Ihnen, die breite Palette der bereits verfügbaren Antikörperflecken zu nutzen, um Zellen, Strukturen und Proteine im Notumepithel zu färben. Wir haben diese Technik für die Immunchemie und DNA-Färbung verwendet.
Diese Dissektion könnte jedoch als Ausgangspunkt für andere Techniken wie die In-situ-Hybridisierung verwendet werden. Dieses Protokoll kann schwierig sein, da Puppen klein und empfindlich sind, so dass es eine ruhige Hand erfordert, um die Dissektion durchzuführen. Und es wird einfacher mit der Erfahrung, also übe an unwichtigen Puppen vor wichtigen.
Beginnen Sie mit dem vorsichtigen Entfernen von drei bis vier Puppen im Stadium P5 mit einem Sezierfernrohr und sammeln Sie sie auf dem Objektträger neben dem Band. Als nächstes legen Sie die Puppen mindestens eine Puppenbreite voneinander entfernt auf das Band, mit ihren Bauchseiten nach unten. Legen Sie nun einen Tropfen Klebekleber auf eine Parrafinfolie oder in einen Zentrifugenrohrdeckel.
Als nächstes tauchen Sie das Ende einer 0,1 bis 10 Mikroliter Pipettenspitze in den Tropfen Klebstoff und klopfen Sie die Pipettenspitze zweimal auf einen Deckschlitten, einen Zentimeter mal einen Zentimeter von einer Ecke entfernt, wodurch eine Linie von Klebekleber entsteht, etwa die Hälfte der Länge der Pupa. Als nächstes stellen Sie eine P2-Pipette auf zwei Mikroliter und eine P200-Pipette auf 200 Mikroliter Volumen vor und montieren sie mit Spitzen. Setzen Sie nun eine Pinzette in der Nähe der Seite des Kopfes ein und entfernen Sie vorsichtig so viel wie möglich vom Pupillengehäuse, wobei Sie von der Vorderseite bis zur Hinterseite arbeiten.
Als nächstes greifen Sie die sich entwickelnden Beine der Puppe mit einer stumpfen Pinzette und ziehen Sie die Puppe vorsichtig aus ihrem Koffer. Legen Sie die Puppe in die Ecke des Deckglases. Greifen Sie die Puppe am hinteren Bauch oder am sich entwickelnden Flügel mit stumpfer Pinzette.
Heben Sie die ventrale Seite der Puppe nach unten und legen Sie sie in die Linie des Klebeklebers. Füllen Sie schnell die P2-Pipette mit zwei Mikrolitern PBS in Einzelstärke, die 0,1 Millimolar Kalzium enthalten, und halten Sie sie in der Luft, stoßen Sie gerade genug aus, um eine kleine Blase an der Spitze zu bilden. Berühren Sie die kleine Blase der Lösung auf einer Seite der Puppe an der Basis des Thorax und wiederholen Sie dann den Vorgang auf der anderen Seite.
Als nächstes füllen Sie die P200-Pipette mit 200 Mikrolitern PBS in Einzelstärke mit 0,1 Millimolar Kalzium, legen Sie dann die Spitze der Pipette über den Thorax und stoßen Sie den Inhalt aus, um die Puppen vollständig zu tauchen, und der Rest des Klebeklebers wird sofort erstarren. Entfernen Sie nun etwa 100 Mikroliter der PBS-Lösung, so dass die Puppe kaum untergetaucht ist, bevor Sie sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren. Um das Notum zu sezieren, greifen Sie eine Mikrodissektionsschere und stützen Sie eine Seite des Griffs gegen den Zeige- und Mittelfinger der dominanten Hand ab, so dass der Daumen der dominanten Hand die Schnittkraft ausübt.
Als nächstes stabilisieren Sie den Hals der Schere gegen den Mittelfinger der nicht dominanten Hand, während Sie den Abdeckschlupf mit dem Ringfinger der nicht dominanten Hand abstützen. Schneiden Sie nun in der Mitte des dorsalen Abdomens ab, um ein kleines Loch von etwa 0,2 bis 0,5 Millimeter zu erzeugen. Um das Rückengewebe zu isolieren, machen Sie kleine 0,5 bis 0,75 Millimeter Schnitte durch das Integument, von der Hinterseite nach der Vorderseite, und am Ende werden diese das Rückengewebe umgeben.
Wiederholen Sie außerdem hintere bis vordere Schnitte auf der anderen Seite der Puppen. Drehen Sie die Sezierstufe, um bei Bedarf einen sauberen Schnitt durch den Kopf zu ermöglichen. Stellen Sie fest, ob das Notum isoliert wurde, indem Sie sehen, ob es leicht bewegt werden kann.
Fügen Sie ungefähr 200 Mikroliter PBS in der Mitte des Deckglases hinzu und machen Sie einen Kanal, der ihn mit dem ursprünglichen Dissektionstropfen verbindet, indem Sie die Pipettenspitze vorsichtig über das Deckglas ziehen, vom neuen Tröpfchen zum ursprünglichen. Drücken oder ziehen Sie mit einer stumpfen Pinzette das isolierte Notum vorsichtig in die Mitte des Abdeckschlupfes und drehen Sie es, so dass die Innenseite nach oben zeigt. Halten Sie das Notum mit stumpfer Pinzette fest, indem Sie in den Bauch- oder Kopfteil drücken.
Entfernen Sie mit einer scharfen Pinzette und sanften Austreibungen von PBS mit einfacher Stärke aus einer 200-Mikroliter-Pipette den verbleibenden Fettkörper, die Muskelbänder oder den Hämolift, um das einschichtige Epithel vollständig freizulegen. Sobald das Gewebe sauber ist, verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um so viel wie möglich von der PBS-Lösung zu entfernen, wobei Sie mit dem Dissektionsbereich überwachen, um eine Aspiration des Notums zu vermeiden. Verwenden Sie nach der maximalen Flüssigkeitsentfernung ein saugfähiges Gewebe, um den Rest des Klebeklebers, der Pupillenkarkasse und anderer Ablagerungen auf dem Deckglas vorsichtig abzuwischen.
Fügen Sie nun 150 bis 200 Mikroliter 4% PFA hinzu und fixieren Sie es für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Und je nach Seziergeschwindigkeit können ein bis drei weitere Puppen seziert werden, während die erste Puppe auf separate Deckzettel fixiert wird. Entfernen Sie die PFA und ersetzen Sie sie durch PBS mit einfacher Stärke, um das Notum einmal für 30 Sekunden zu waschen.
Wenn Sie mit der Antikörperfärbung fortfahren, führen Sie drei fünfminütige Wäschen in PBS oder PBST mit einfacher Stärke durch, um das Gewebe zu durchdringen, wenn das Antigen intrazellulär ist. Die Probe kann in PBS mit einer Festigkeit von 0,02% Natriumazid über Nacht in einer befeuchteten Kammer gelagert werden. Bereiten Sie nach der Färbung einen neuen Deckzettel vor, der als Topper bezeichnet wird, mit Stützen.
Erzeugen Sie einen Spalt von etwa 200 Mikrometern, indem Sie Abstandshalter aus 22 x 22 Abdeckschüben in der Mitte des Toppers verwenden, die etwa einen Zentimeter voneinander entfernt sind. Um zu kleben, lackieren Sie die Naht des Abstandshalters, die am weitesten von der Mitte entfernt ist, mit einer dünnen Schicht Nagellack und lassen Sie sie dann trocknen. Entfernen Sie so viel wie möglich von der wässrigen Lösung aus der Probe und tragen Sie sofort zwei Tropfen Anti-Fade-Montagemedium auf die Probe auf.
Verwenden Sie bei Bedarf eine saubere scharfe Pinzette, um das Notum in der mittleren Tröpfchenmitte der Anti-Fade-Montage zu positionieren. Legen Sie den Deckzettel mit dem Notum auf eine etwa 10 x 40 Millimeter große Schaumstoffstütze, um die Probe so anzuheben, dass sie nicht an der Arbeitsfläche haftet. Lassen Sie den Topper unter einem Sezierfernrohr langsam auf die Probe ab.
Sobald das Anti-Fade-Montagemedium auf den Topper trifft, lassen Sie es vorsichtig los und lassen Sie die Kapillarwirkung den Topper nach unten ziehen. Legen Sie ein weiteres Stück Schaumstoff auf den Topper und verwenden Sie einen Standard-Objektträger als Gewicht, um das Anti-Fade-Montagemedium vorsichtig zwischen dem Probendeckel, dem Topper und den Abstandshaltern zu entlocken. Verwenden Sie nach 5-10 Minuten ein saugfähiges Gewebe, um überschüssiges Anti-Fade-Montagemedium abzuleiten, indem Sie die Kanten des Deckglases vorsichtig berühren.
Tragen Sie vorsichtig Nagellack auf jede Ecke der Deckblätter auf, um sie zusammenzukleben. Um zu verhindern, dass sich der Deckschlupf verschiebt und das Rückengewebe beschädigt, vermeiden Sie zuerst die Beschichtung der Kanten, und sobald der Nagellack in den Ecken getrocknet ist, lackieren Sie alle Kanten der Abdeckschlüsse, um sie zu versiegeln. Dieses Protokoll ermöglicht die Bildgebung der fixierten Proben unter Verwendung von Antikörpern und Zellflecken.
Dieses Protokoll kann für Proben verwendet werden, die zuvor verwundet und live abgebildet wurden. Ein Vergleich von Live- und fixierten Bildern zeigt, dass das Protokoll die Gewebearchitektur und -morphologie bewahrt. Das Protokoll erlaubt verschiedene Ansichten eines sezierten Notums.
Die apikale Ansicht ist ideal für die Visualisierung von Epithelzellrändern und Kernen unterhalb der Kutikula. Die basale Ansicht zeigt besser basale Strukturen am Wundrand. Achten Sie darauf, das Notum während der Dissektion nicht zu verbiegen oder zu verziehen.
Schneiden Sie ein flaches Stück, indem Sie die seitlichen Kanten vermeiden. Schneiden Sie nicht zu nahe an den Bauchseiten, da es sich sonst während der Montage verformt. Nach der Sezierung eines Pupillennotums konnten viele andere Techniken angewendet werden, wie Elektronenmikroskopie und Querschnitt.
Diese Techniken könnten es ermöglichen, zuvor abgebildete Strukturen in immensen Details zu untersuchen.
