Innerhalb mehrzelliger Organismen zeigt Gewebe in ihrer räumlichen Ausrichtung hohe Grade weiter an. Zellen richten aus und zeigen einen Schwerpunktbereich über große Entfernungen im Verlauf der Morphogenese an. Um zu verstehen, wie die planaren Anordnungen von Epithelien während der Entwicklung erreicht werden, ist es entscheidend, die Ausrichtungen und Wachstumsdynamiken der Zelle mit hoher räumlicher zeitlicher Treue in vivo zu verfolgen.
Das beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um Zellverhalten auf globaler und lokaler Ebene in der drosophila pupal epidermis abzubilden und zu analysieren. Diese Methode könnte Einblicke in verschiedene Theorie der Forschung, Zellbiologie, Morphogenese und planare Polarität bieten und kann auf die Analyse anderer Gewebe, Strukturen und Modelle angewendet werden. Alle Schritte können nach einiger Übung einfach ausgeführt werden.
Sie verlangen Präzision. Die Visualisierung dieses Protokolls trägt dazu bei, in kürzerer Zeit optimale Ergebnisse zu erzielen. Die Pupal-Sektion ist komplex.
Zunächst verwenden Sie einen befeuchteten Pinsel, um inszenierte weiße Pre-Pupae in eine frische Plastikflasche zu übertragen und sie dort so lange wie nötig bei 25 Grad Celsius aufzubewahren. Dann entfernen Sie jede Pupae von der Wand der Durchstechflasche mit Hilfe von Zangen. Kleben Sie die ventrale Seite jeder Pupa auf einem Glasschlitten, der mit doppelseitigem Klebeband bedeckt ist.
Tippen Sie vorsichtig auf die Kopfspiracles und die dorsale Oberfläche der Pupa mit den Spitzen der Zange, um die Haftung des Pupal-Gehäuses auf dem Band zu gewährleisten. Beginnen Sie mit der Zerlegung unter einem Stereomikroskop, indem Sie das Operculum mit der Zange sanft aus dem Puparium entfernen. Legen Sie eine Spitze der Zange in eine flache zwischen dem Pupalgehäuse und der Pupa-Oberfläche durch die Operkuläre Öffnung.
Reißen Sie das Gehäuse seitlich in einer oder mehreren Schaukeln von Kopf zu Schwanz, um zu vermeiden, dass die Pupa eingeklemmt wird. Falten Sie das rissige Pupal-Gehäuse an die Seiten zurück, während Sie weiter zum hinteren Ende gehen. Entfernen Sie die Pupa aus dem geöffneten Pupal-Gehäuse, indem Sie die Zange vorsichtig unter das Tier einsetzen und sanft nach oben ziehen.
Der Pupa klebt an der Spitze der Zange. Halten Sie die Pupa vorsichtig an der ventralen Seite, und übertragen Sie die Pupa auf eine Glasbodenschale auf einem kleinen Tropfen gasdurchlässigem Halocarbonöl. Rollen Sie ein Stück nasses Gewebepapier an den Rändern der Schale und decken Sie die Schale, um feuchtigkeit zu halten.
Richten Sie die Pupa über den Öltropfen auf den Glasbodenschalen entsprechend der Domäne und dem zu bewertenden Prozess aus. Für langfristige Live-Bildgebung der frühen Expansion der Dorsalnester, dorsal seitlich orientieren die Pupa. Um ihre späte Expansion und Gewebeumgestaltung abzubilden, orientieren Sie die Pupa dorsal.
Übertragen Sie die Glasbodenschale mit den montierten Welpen auf die Mikroskopstufe und konzentrieren Sie sich mit durchlichten Licht auf die Oberfläche des Bauchbereichs. Um eine mitotische Rekombination einzusetzen, um genetische Mosaike im Bauchepithel zu induzieren, bereiten Sie jungfräuliche Weibchen vor, die eine Hitzeschock-induzierbare Flipase, eine FRT-Stelle an einem bestimmten genomischen Ort und einen erkennbaren zellulären Marker distal zur FRT-Stelle tragen. Bereiten Sie mutierte Männchen vor, die eine FRT-Stelle am entsprechenden genomischen Standort tragen.
Kreuzen Sie mehrere Weibchen und Männchen in einem Drei-zu-ein-Verhältnis in einer Plastikflasche bei 25 Grad Celsius für vier bis fünf Tage. Um somatische Klone in den Histoblasten zu erzeugen, führen Sie eine Hitzeschockbehandlung im dritten Larvenstadium der Nachkommenschaft des Kreuzes durch, indem Sie die Plastikfläschchen, die die Tiere in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius enthalten, 45 Minuten bis eine Stunde lang untertauchen. Verwenden Sie in der Bild-J-Software die maximale Intensitätsprojektionsfunktion, um die Z-Stack-Slices zu schützen, die durch konfokale Mikroskopie in 2D erfasst werden.
Die Nester haben eine charakteristische Form, die sie in einem planaren Koordinatensystem nach links und dorsal nach oben ausrichtet. Um mit dieser Analyse optimale Ergebnisse zu erzielen, muss das Eingangsbild mit hoher Auflösung erfasst werden. Um qualitative Orientierungswerte an lokalen Zellkanten zu erhalten, klicken Sie auf das Plug-In-Menü und wählen Sie die Option Ausrichtung J-Verteilung.
Legen Sie das Gaußsche Fenstersigma auf ein Pixel, den kubischen Spline auf Gradient, die minimale Koherenz auf 20 Prozent und die minimale Energie auf ein Prozent fest. Verwenden Sie die Farbvermessungsoption des Plug-Ins. Legen Sie Farbton auf Ausrichtung, Sättigung auf Koherenz und Helligkeit für das Eingabebild fest.
Diese Farbe kodiert Zellenkantenausrichtungen relativ zum festgelegten planaren Koordinatensystem. Verwenden Sie anschließend im Plug-In-Menü die Option Ausrichtung J, um zelluläre Ausrichtungen und die Ausrichtung der Zelle zu der Zellausrichtung zu quantifizieren. Generieren Sie kleine, benachbarte, nicht überlappende Bereiche mit gleichem Gewicht von etwa 20 Mikrometern mal 20 Mikrometern innerhalb des von den Histoblasten belegten Bereichs.
Das Pressing-Measure berechnet die vorherrschende lokale Ausrichtung und Koherenz aus den ROIs. In dieser Studie ist die verwendete Methodik in der Lage, hochauflösende Filme der sich entwickelnden Pupae für Zeiträume von bis zu 48 Stunden ohne signifikante Fotobleiche oder Fototoxizität zu erzeugen. Beispiele für Wilde-Klone, die durch das Fehlen von RFP NLS und ihren Zwillingsflecken 26 Stunden nach der Pupariumbildung gekennzeichnet sind, werden hier gezeigt.
Die Klone haben sich entlang der Segmentgrenzen gestreckt. Zwillingsklone parallel oder parallel angeordnet. Die Morphologie eines Wild-Typ-Klons nach 26 Stunden und 47 Stunden nach der Pupariumbildung zeigt in beiden Stadien eine komplexe Grenzmorphologie.
Box- und Schnurrhaare für geometrische Parameter bei 26 Stunden und 47 Stunden nach der Pupariumbildung zeigen, dass die durchschnittliche Fläche und der Umfang in diesem Zeitfenster signifikant angestiegen sind. Die Orientierung des Klons wurde während der Erweiterung und des Umbaus aufrechterhalten. Formparameter bei 26 Stunden und 47 Stunden nach der Pupariumbildung zeigen die Rauheit, Rundheit und Zirkularität kaum verändert in den wilden Typ Klone.
Achten Sie darauf, die Pupa nicht zu beschädigen, sonst wird es innerhalb weniger Stunden sterben, Auswirkungen auf Live-Bildgebung. Für dieses Protokoll ist kein Sartusreagenz oder -instrument erforderlich. Vermeiden Sie es, sich beim Sezieren zu kneifen.
Durch die Anwendung dieser Methoden möglich, hochauflösende Filme für lange Zeiträume mit verschiedenen Imagine-Techniken zu generieren. Focal zu Photonen oder Spinnen Vonscheiben. Chloralanalyse kann verwendet werden, um nicht-autonome Reaktionen zu erforschen, da zufällige Zellen bei der Identifizierung von Kreuzgesprächen oder Zellkommunikationsmechanismen erleichtern.
Diese Methoden können leicht angepasst werden, um eine vollständige Palette von morphogenetischen Phänomenen zu studieren, einschließlich der Koordination der epidermalen, muskulösen und Neuroentwicklung während der Metamorphose.
