Dieses Protokoll präsentiert eine Methode zum Live-Bild, Fliegen olfaktorische Schaltkreis-Montage auf Einzelaxon-Ebene von einem sich entwickelnden Gehirn. Dissektion Um das Gewebe zu reinigen, das das sich entwickelnde Gehirn bedeckt, können wir qualitativ hochwertige Bilder aus dem inneren Gehirn sammeln. Diese Methode liefert wertvolle Einblicke in die zellbiologischen Grundlagen der Schaltkreisentwicklung.
Es kann leicht modifiziert werden, um auch die Entwicklung anderer Schaltungen zu untersuchen. Es dauert einige Zeit, bis eine Person eine stabile Handkontrolle in der Mikrodissektion durchführt. Mehr Übung wird hilfreich sein.
Bereiten Sie zunächst die Kulturschale für die Mobilisierung des Explants während der Zeitrafferbildgebung vor, indem Sie 0,5 Zentimeter dicke Sylgard auf die Unterseite einer Petrischale legen und sie 48 Stunden bei Raumtemperatur aushärten lassen. Um Mikrostifte für die Immobilisierung des Explants auf dieser Platte mit einer Pinzette vorzubereiten, kleben Sie mehrere Mikrostifte auf ein Band, wobei die scharfen Enden auf einer Seite ausgerichtet sind, und schneiden Sie zwei Millimeter scharfe Enden mit einer Schere. Setzen Sie dann mit der Pinzette die geschnittenen Mikrostifte in die Sylgard-Schicht einer vorgefertigten Sylgard-Platte ein.
Sammeln Sie mit einem Pinsel weiße Puppen, die innerhalb einer Stunde Puparium bilden, und übertragen Sie sie in ein neues Fläschchen. Inkubieren Sie die Puppen im Wasserbad, das bei 37 Grad Celsius temperiert ist, für 40 Minuten, um spärliche ORN-Klone aus zufälligen Typen zu induzieren. Nach einem Hitzeschock die Durchstechflasche 30 Stunden lang auf 25 Grad Celsius stellen, wodurch die Puppen 30 Stunden nach der Pupariumbildung gealtert sind.
Dann bereiten Sie das Kulturmedium für Explantation wie im Textmanuskript beschrieben vor und lagern Sie es bei vier Grad Celsius. Am Tag der Bildgebung fügen Sie fötales Rinderserum, Humaninsulinbrüllösung und 20 Hydroxyecdyson-Stammlösung, die in Ethanol gelöst wird, zu einer 50-Milliliter-Durchstechflasche hinzu, die 45 Milliliter Drosophila-Medium von Schneider enthält. Gut mischen und 15 Milliliter des vollen Mediums in ein neues 50 Milliliter konisches Rohr überführen und den Rest des vollen Mediums eine Woche lang bei vier Grad Celsius lagern.
Decken Sie dann die Röhrenöffnung mit Vollmedium mit Paraffinfilm ab und versorgen Sie das Medium mit Sauerstoff, indem Sie Sauerstoffblasen unter der flüssigen Oberfläche durch eine sterile Fünf-Milliliter-Pipettenspitze mit einer Blase pro Sekunde für 20 bis 30 Minuten pumpen. Als nächstes sterilisieren Sie die Oberfläche der Dissektionsbohrung und die zuvor vorbereitete Sylgard-Platte mit 70% Ethanol und lassen Sie sie vor Gebrauch trocknen. Verwenden Sie einen Pinsel, um 30 Stunden APF-Puppe auf ein Seidenpapier zu übertragen, um die äußere Oberfläche der Puppe für fünf Minuten zu trocknen.
Nachdem Sie doppelseitiges Klebeband auf einen Glasobjektträger aufgetragen haben, befestigen Sie die getrocknete Puppe vorsichtig an der klebrigen Oberfläche des Bandes, wobei die Rückenseite nach oben zeigt. Drücken Sie die Puppe vorsichtig mit einer Bürste, um die Bauchseite richtig am Klebeband zu befestigen, ohne die Puppe zu beschädigen. Führen Sie eine scharfe Spitze der Pinzette zwischen der braunen Puppenkoffer und der Puppe von der seitlichen Seite ein und brechen Sie die braune Puppenkoffer vorsichtig durch eine Linie zum hinteren Ende der Puppe.
Sobald die braune Puppenkoffer geöffnet ist, halten Sie die Puppe vorsichtig mit der Pinzette fest und geben Sie sie in den Sezierbrunnen, der einen Milliliter sauerstoffreiches Vollmedium enthält. Tauchen Sie die Puppe in das Medium, um sie auf den Boden des Brunnens zu senken. Um das Antennengehirn aus der Puppe zu sezieren, halten Sie die Puppe vorsichtig mit einer Pinzette mit einer Hand und mit einer Mikroschere, erzeugen Sie ein kleines Loch von der hinteren Seite der Puppe, das hohen Druck in der Puppe freisetzt.
Ausgehend vom Loch schneiden Sie durch die ventrale Mittellinie bis zum Hals, schneiden Sie dann durch den Umfang des Halses, um den Kopf vom Körper der Puppe zu lösen und den Körper in einen anderen Brunnen zu legen. Als nächstes schneiden Sie die transparente Kutikula ab, die die dorsale Seite des Gehirns bedeckt, um den Fettkörper auf dem Gehirn freizulegen, um sicherzustellen, dass die Kutikula, an der die Netzhaut und die Antenne befestigt sind, erhalten bleiben, und schneiden Sie in ähnlicher Weise die Kutikula von der ventralen Seite des Gehirns ab. Pipettieren Sie das Medium in Richtung der offenen Regionen auf der dorsalen und ventralen Seite des Kopfes mit einer P10-Pipette, um den Fettkörper, der das Gehirn und die Antenne bedeckt, sanft auszuwaschen.
Um die Interaktion von bilateralen ORN-Axonen oder ORN-Axonen mit PN-Dendriten-Targeting zu untersuchen, trennen Sie den Antennennerv während des Stadiums, indem Sie die Klingen der Mikroschere vorsichtig zwischen der Kutikula und dem Gehirn platzieren und den interessierten Antennennerv durchtrennen. Um das sezierte Explantat auf die Sylgard-Platte zu übertragen, legen Sie etwa 200 Mikroliter Tröpfchen des oxygenierten Vollmediums auf die Sylgard-Oberfläche. Pipette den Fettkörper, der aus dem sezierten Stamm stammt, mehrmals durch eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze zur Beschichtung der inneren Oberfläche, um zu verhindern, dass die Explantate während des Transfers von der Dissektionsmulde auf den mittleren Tröpfchen auf der Sylgard-Platte an der Pipettenspitze haften.
Verwenden Sie die Pinzette, um das Explantat auf der Sylgard-Schicht in den beiden optischen Lappen zu befestigen, positionieren Sie dann vorsichtig die Sylgard-Platte auf der Bildgebungsstation, immobilisieren Sie die Platte mit Bändern und fügen Sie der Sylgard-Platte langsam 10 Milliliter des sauerstoffhaltigen Vollmediums mit einer P1000-Pipette hinzu. Die ORN-Axone kommen zwischen 18 Stunden und 36 Stunden APF am Antennenlappen an und navigieren dann durch den Antennenlappen, überqueren die Mittellinie und erneuern die Glomeruli. Vor der Registrierung zeigten die Axone eine gewisse seitliche Drift, als sich das Gehirn entwickelte, und nach der Registrierung wurde die Drift korrigiert.
Die glomerulären Identitäten der extrahierten ORN-Axone wurden durch Immunfärbung eines Neuropil-Markers und Cadherins aufgedeckt. Durch den Vergleich mit der internen Lappenkarte konnte die Identität jedes Glomerulus bestimmt werden. Während der Ex-vivo-Kultur verursacht das Bakterienwachstum in der Regel eine ausgeruhte Entwicklung des Riechkreises.
Daher ist es wichtig, die Kulturschale und die Stifte vor der Bildgebung gründlich zu sterilisieren und den Bildgebungsraum sauber und isoliert zu halten. Um eine höhere räumliche zeitliche Auflösung zu erreichen, kann dieses Explantationssystem mit einem fortschrittlicheren Mikroskop, dem Gitterlichtmikroskop der adaptiven Optik, abgebildet werden. Obwohl hier exemplarisch eine Fabrikschaltungsentwicklung gezeigt wurde, kann dieses System potentiell auf Studien anderer Schaltkreise und Entwicklungsprozesse im sich entwickelnden Zentralgehirn ausgeweitet werden.
