Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Science Foundation unterstützt.

1. Tag 1 Bevor Sie beginnen: Eine gesunde Bevölkerung von Fliegen sollte beibehalten unter Verwendung von Standard-Protokollen Kultivierung werden: remove Erwachsene aus Flaschen oder Ampullen nach 3-4 Tagen von Ei-legen und damit die Entwicklung auf eine konstante Temperatur bis wandernde 3 rd Larvenstadium initiieren pupariation gehen. Die Larven / Puppen Übergang wird durch die Bildung der prepupae (als 0 Stunden nach Puparium Bildung-APF) markiert. Immobile Puppen sind aus älteren Puppen durch ihre weiße Färbung und von Larven, die noch nicht pupariation durch ihre längliche, runde Form und Vorwölbung der vorderen Stigmen begonnen unterschieden. Sie benötigen: <ul><li> Ein Pinsel für das Sammeln Puppen </li><li> Eine feuchte Kammer zur Kultivierung von Puppen: Eine Petrischale mit benetzt Papiertuch ausgekleidet und mit Filterpapier für die verschiedenen Zeitpunkte der Erhebung, Genotyp und Geschlecht der Puppen markiert </li><li> 1X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zum Waschen Puppen </li></ul> Sammlung, Kultivierung und Inszenierung Puppen <ol><li> Mit einem benetzten Pinsel entfernen sanft 0HR APF Puppen aus der Kultur-Flaschen / Vials und legen Sie sie in den Deckel der feuchten Kammer. </li><li> Mit dem Pinsel und 1X PBS vorsichtig waschen die Puppen, um Schmutz aus der Puppe Fall entfernen </li><li> Gegebenenfalls Art der Puppen nach Geschlecht. Die Gonade Primordien der Puppen können verwendet werden, um den Geschlechtern zu sortieren. Die männlichen Keimdrüsen Primordien sind eine seitliche Paar transluzenten Scheiben leicht durch die Puppenstadium Nagelhaut ca. 2 / 3 über die gesamte Länge des Körpers 5 zu sehen. Die weibliche Gonade Primordien sind kleiner und nicht so leicht zu erkennen. </li><li> Legen Sie die Puppen in die entsprechend gekennzeichneten Position in der feuchten Kammer und zurück auf eine konstante Temperatur. Kultur an den entsprechenden Entwicklungs-Zeitpunkt. </li></ol> 2. Tag 2: Dissection, Fixierung und primäre Antikörper-Inkubation Bevor Sie beginnen: Sie benötigen: <ul><li> Dissection Stereomikroskop </li><li> Chirurgische Pinzette </li><li> Chirurgische Skalpell mit der Nummer 11 Klingen </li><li> Zwei neun und Glas Depression Gerichte (Corning Produkt # 7220-85) <ul><li> Fill Brunnen von einem Gericht mit 1X PBS: Dies ist die Spülung Gericht zur Reinigung zerlegt Puppen </li><li> Fill Bohrungen der zweiten Schale mit Fixierung Puffer </li></ul></li><li> Feuchten Kammer für die Antikörper-Inkubation. Wir verwenden Kunststoff verschließbaren Sandwich-Boxen mit benetzt Papierhandtücher ausgekleidet. </li><li> Fixation Puffer: 1x PBS, 4% Paraformaldehyd, 0,2% Desoxycholsäure (zur Permeabilisierung) </li><li> Dissection Plattform: Clear Objektträger mit einem Stück doppelseitigem Klebeband verklebt auf einer Seite </li><li> 1X PBS </li><li> p100 oder p200 Pipette </li></ul> Zergliederung <ol><li> Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Puppen eine nach der anderen und sie auf die Zerlegung Plattform mit dem vorderen Ende der Puppen mit Blick auf den breitesten Breite des Bandes. Wenn Puppen übermäßig nass sind, zuerst blot sie trocken mit einem Papiertuch. </li><li> Bevor die Puppen ganz auf das Band geklebt haben, verwenden Sie einen Pinsel zu positionieren. </li><li> Lassen Sie die Puppen an der Luft trocknen und halten, um das Band (5-10 Minuten) </li><li> Mit dem chirurgischen Skalpell sezieren jeden Puppen bilateral. Dies geschieht am besten mit einer einzigen schnellen Schnitt von der vorderen bis zum hinteren Ende der Puppen erreicht. Wenn richtig gemacht, wird der Schnitt halbieren beiden vorderen und hinteren Luftlöcher Paaren. Dissect nicht mehr als 10 Puppen in einer Zeit, als Wasch-und Reinigungsmitteln die Proben schnell ist notwendig, um proteolytische Schädigung des Gewebes zu verhindern. </li><li> Mit einem Pinsel, Übertragung einer kleinen Menge 1X PBS in jedes seziert Puppen, um sie von dem Band zu lösen. </li></ol> Reinigung, Fixierung und primäre Antikörper-Inkubation <ol start="6"><li> Mit einem Paar chirurgische Pinzette fassen eine individuelle Puppe ein halb nach vorn und sofort eintauchen in eine Vertiefung der Spül-Schüssel. Die Dissektion Plattform soll durch die Spülung Schüssel auf dem Mikroskoptisch ersetzt werden. Die Puppen Fall sollte auf die Probe belassen werden, bis die Bearbeitung abgeschlossen ist und die Proben sind bereit zur Montage. </li><li> Während noch Ergreifen der Puppe die Hälfte verwendet eines Pipettierautomaten vorsichtig abwaschen das innere Gewebe des Bauches. Zu viel Druck beim Waschen kann zum Verlust von Epithelzellen führen. </li><li> Sofortüberweisung das saubere Puppe Hälfte Fixierung Puffer bei Raumtemperatur und Verfahren die restlichen Puppe Hälften ähnlich. Mit ein wenig Übung, Dissektion und Waschen von 20 Puppe Hälften sollte weniger als 5 Minuten. </li><li> Lassen Sie Puppen in Fixierung Puffer bei Raumtemperatur inkubieren für 1 (eine) Stunde. </li><li> Spülen festen Puppen 3x 5 Minuten in 1X PBS </li><li> Die Proben können sofort für die Immunhistochemie verarbeitet werden oder in 100% Ethanol bei -20 ° C gelagert werden für bis zu 3 Monaten ohne Verlust von Zellen oder Epitop Reaktivität. </li><li> Zum Speichern von Proben, äquilibrieren Proben durch eine VerdünnungSerie von PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) bei Raumtemperatur für 20 Minuten in jeder Verdünnung vor der Übertragung zu 100% EtOH. </li><li> Proben müssen erneut in PBS äquilibriert durch die Reverse-Serie vor der Verarbeitung für die Immunhistochemie. </li><li> Block-Proben in 1x PBS (ergänzt mit 2% Rinderserumalbumin) für 1 (eine) Stunde vor der Zugabe des primären Antikörpers. </li><li> Inkubieren mit dem primären Antikörper verdünnt, um geeignete Konzentration in 1X PBS über Nacht bei 4 ° C, ohne Schaukeln. </li></ol> 3. Tag 3: Sekundäre Antikörper-Inkubation, Montage-und Imaging- Bevor Sie beginnen: Sie benötigen: <ul><li> Zwei chirurgische Zange </li><li> Montage Medien (Glycerin, Vectashield [Vector Labs] oder Slowfade Gold [Invitrogen]) </li><li> Depression und Objektträger (0,8 mm) </li><li> Deckgläser (24 x 40 mm) </li></ul> Sekundäre Antikörper-Inkubation und Montage: <ol><li> Wash-Proben 3x 10 Minuten mit jeweils 1x PBS </li><li> Block-Proben in 1x PBS (ergänzt mit 2% Rinderserumalbumin) für 1 (eine) Stunde vor der Zugabe des sekundären Antikörpers. </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper verdünnt, um geeignete Konzentration in 1X PBS bei Raumtemperatur im Dunkeln, ohne Schaukeln für 3 (drei) Stunden. </li><li> Wash-Proben 3x 10 Minuten mit jeweils 1x PBS </li><li> Gegebenenfalls Gegenfärbung Puppen (Beispiel haben wir Flecken Kerne mit DAPI [4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindole] in PBS für 10 Minuten verdünnt). </li><li> Äquilibrieren Proben (mindestens 30 Minuten) in geeigneten Medien vor der Montage. </li><li> Bereiten Sie eine Probe gleiten. Die Morphologie der Puppen verhindert flache Montage. Die Proben werden in die Vertiefung einer Depression slide (tropfen) für die Bildgebung montiert. Legen Sie 75-100 ul der Montage Medien in die Depression gut. Mehrere Proben können auf einer einzelnen Folie angebracht werden. </li><li> Die Puppe Fall muss aus den Proben vor der Montage entfernt werden. Fassen Sie eine individuelle Puppe Fall anterior Dabei bitte nicht auf den internen Puppenstadium Membran zu erfassen. </li><li> Mit einer zweiten Pinzette vorsichtig greifen die internen Puppenstadium Membran durch den Kopf und entfernen Sie sie aus der Puppenhülle. </li><li> Unmittelbar Übertragung der Probe auf die Depression gut und die Verarbeitung fortzusetzen zusätzliche Proben. </li><li> Mit einer Sonde oder Pinzette Position der Proben gleichmäßig in die Depression auch mit den seitlichen Oberfläche nach oben zeigt. Gelegentliche Luftblasen können mit einer Sonde entfernt werden. </li><li> Senken Sie das Deckglas auf den Proben dabei nicht um Luftblasen zu präsentieren </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: Die Proben unter Verwendung dieses Protokoll erhalten die grobe Morphologie der erwachsenen Bauch. Bild Stapel können projiziert, um eine zweidimensionale Bild-oder 3-D Rendering angewendet werden, um Bauch-Topologie untersuchen zu generieren. <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Segmentation Genprodukte in Drosophila Puppen Wingless Protein und Engrailed Ausdruck (En-Gal4: UAS-GFP). Wurden 26 Stunden nach Puparium Bildung (APF) visualisiert mit Maus anti-Wg (4D4: Iowa Hybridoma Bank) und anti-GFP. 10-facher Vergrößerung ist vorderen linken und dorsal wird. Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt. Stacks von ca. 50 Bilder (DELTA Z zwischen den Schichten ist 2.5μm) projiziert wurden.

<ol>
	<li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila.">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li><li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis.">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li><li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+rearrangements,+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila.">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li><li>Matsuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Morphology+and+evolution+of+the+insect+abdomen.">in Morphology and evolution of the insect abdomen.</a> , (1976).</li><li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster.">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Techniken in diesem Video präsentiert werden verwendet, um Drosophila Puppen aus einer Vielzahl von Entwicklungs-Zeitpunkten vorzubereiten. Puppen in der Zeit von 24 Stunden APF zu 32 Stunden bearbeitet APF sind besonders anfällig für Zell-Verlust aus dem Epithel. Die Verwendung von Waschmitteln (wie z. B. Triton X-100 und Tween-20) während der erweiterten Inkubationsschritte erhöht die Wahrscheinlichkeit von Zell-Verlust und wird daher nicht empfohlen. Vielmehr ist Desoxycholsäure als Reinigungsmittel in der ersten Fixierung Schritt verwendet. Alle weiteren Schritte sind in 1X PBS ohne Waschmittel durchgeführt. Außerdem rocken Proben während längerer Inkubationsschritte erhöht Zellverlust und sollte vermieden werden. Die Proben können abgebildet mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie-Techniken sein. Allerdings verarbeitet Drosophila Puppen wie beschrieben kann auch abgebildet mit einem Structured Illumination Microscopy System Nachgeben Bildqualität vergleichbar mit der konfokalen Techniken.

<ul><li> Dissection Stereomikroskop </li><li> Chirurgische Pinzette </li><li> Chirurgische Skalpell mit der Nummer 11 Klingen </li><li> Neun-Loch-Glas Depression Gerichte (Corning Produkt # 7220-85) </li><li> Feuchten Kammer zur Kultivierung von Puppen </li><li> 1X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) </li><li> Nr. 11 chirurgische Skalpell </li><li> doppelseitigem Klebeband </li><li> Fixation Puffer: 1x PBS, 4% Paraformaldehyd, 0,2% Desoxycholsäure (zur Permeabilisierung) </li><li> p100 oder p200 Pipette </li><li> Depression und Objektträger (0,8 mm) </li></ul>

drosophila pupal abdomen immunohistochemistry

Die Drosophila Puppenstadium Bauch ist ein etabliertes Modellsystem für die Untersuchung von epithelialen Morphogenese und die Entwicklung von sexuell dimorphen Morphologien 1-3. Während der Verpuppung, die etwa 96 Stunden umfasst (bei 25 ° C), ersetzen proliferierenden Populationen von imaginalen Zellen der larvalen Epidermis der Erwachsenen Abdominalsegmente zu generieren. Diese imaginäre Zellen, geboren während der Embryogenese, als seitliche Paar histoblast Nester in jedem Abdominalsegment der Larven vorhanden sind. Vier Paare von histoblast Nestern führen zu den Erwachsenen dorsalen Kutikula (vordere und hintere dorsale Nester), das ventrale Kutikula (ventral Nester) und die Luftlöcher, wobei jedes Segment (Luftloch Nester) 4 verbunden. Nach puparation, beginnen diese diploiden Zellen (unterscheidbar nach Größe von den größeren polyploiden larvalen Epidermiszellen-LECs) eine stereotype Prozess der Proliferation, Migration und Austausch der LECs. Verschiedene molekulare und genetische Werkzeuge können eingesetzt werden, um die Beiträge der genetischen Ursachen der Morphogenese der erwachsenen Bauch beteiligt zu untersuchen. Ultimative Erwachsenen Phänotypen sind in der Regel folgende Zerlegung der erwachsenen abdominale Nagelhaut analysiert. Allerdings erfordert Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Prozesse immunhistochemischen Analysen der Puppenstadium Epithel, das einzigartige Herausforderungen. Zeitlich dynamische Morphogenese und die Interaktionen von zwei verschiedenen epithelialen Populationen (Larven-und imaginären) erzeugen eine fragile Gewebe anfällig für übermäßige Zellverlust während der Präparation und die anschließende Verarbeitung. Wir haben Methoden zur Präparation, Fixierung, Montage-und Imaging-der Drosophila-Puppen abdominem Epithel für immunhistochemische Studien, die eine gleichbleibend hohe Qualität Proben geeignet für die konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie oder Standard generieren entwickelt.

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Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antikörper-Färbung der<em&gt; Drosophila</em&gt; Puppen verbessern können genetische Analysen von Erwachsenen abdominale Entwicklungsgenetik. Wir präsentieren unsere Protokoll für die Präparation, Fixierung und Antikörper-Färbung der inszenierten<em&gt; Drosophila</em&gt; Puppenstadium Bauch.

Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

drosophila-pupal-abdomen-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

16.2K Aufrufe.  University of Alabama. Antikörper-Färbung der Drosophila Puppen verbessern können genetische Analysen von Erwachsenen abdominale Entwicklungsgenetik. Wir präsentieren unsere Protokoll für die Präparation, Fixierung und Antikörper-Färbung der inszenierten Drosophila Puppenstadium Bauch.

Serie: Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Dünnschnitt der Scheibe Vorbereitungen für die Immunhistochemie

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Forschung

Biologie

In situ Protocol for Butterfly Pupal Wings Using Riboprobes

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ hybridizations, a mainstay of developmental biology, are useful to study the spatial and temporal patterns of gene expression in developing tissues at the level of transcription. If antibodies that target the protein products of gene transcription have not yet been developed, and/or there are multiple gene copies of a particular protein in the genome that cannot be differentiated using available antibodies, in situs can be used instead. While an in situ technique for larval wing discs has been available to the butterfly community for several years, the current protocol has been optimized for the larger and more fragile pupal wings.

In order to examine gene expression in the pupal wing tissue of Bicyclus anynana, we present an optimized protocol for in situ hybridizations using riboprobes. We also provide guidelines for the further optimization of this protocol for use in pupal wings of other Lepidopteran species.

In situ-Protokoll für Butterfly Puppenstadium Flügel mit Ribosonden

Here we present, in video format, a protocol for in situ hybridizations in pupal wings of the butterfly Bicyclus anynana using riboprobes.  In situ ...

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

Immunhistochemie: Paraffin Schnitte mit der Vectastain ABC Kit von Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Immunhistochemie auf Paraffinschnitten von Mouse Epidermis unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörper

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila Larven NMJ Immunhistochemie

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

Ex-vivo-Kultur von Drosophila Pupal Hoden und Single männlichen Keim Online-Zysten: Dissection, Imaging und pharmakologische Behandlung

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Dissection und Montage<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Eye Discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.