Diese Methode verwendet grüne Kaffeefrüchte, um die Toxizität von Insektiziden gegen den Kaffeebeerenzünsler zu testen. Die Insektizidanwendung wird vor oder nach dem Insektenbefall durchgeführt, um die Insektensterblichkeitsabweisung und andere Auswirkungen zu untersuchen. Die Verwendung von echtem Rohkaffee mit Nährstoffen, die für das Insektenwachstum geeignet sind, ist der am besten geeignete Weg, um die Toxizität von Verbindungen für Insekten unter simulierten natürlichen Bedingungen zu bewerten.
Das Protokoll ermöglicht die Bewertung der toxischen Wirkungen von chemischen Insektiziden und gegenüber Krankheitserregern wie Pilzen oder abweisenden Substanzen. Diese Infektion der Früchte und der Insekten ist der kritische Schritt, da eine unsachgemäße Desinfektion aufgrund von Kontamination zum Tod von Insekten führen kann. Die Qualität der Insekten ist ebenfalls wichtig, da schwache Insekten die Ergebnisse eines giftigen Produkts überschätzen.
Die visuelle Demonstration ermöglicht die Identifizierung des geeigneten Stadiums der Früchte des Insektenbefallsprozesses, des geeigneten Zeitpunkts, um die giftige Substanz zu verbreiten. Und der Weg zum Sezieren der Früchte. Das Verfahren wird Claudia Martinez, wissenschaftliche Mitarbeiterin aus dem Labor, demonstrieren.
Um zu beginnen, sammeln Sie die grünen Kaffeefrüchte früh am Morgen mit dem ungefähren Entwicklungsalter von 120 bis 150 Tagen nach der Blüte von Kaffeeplantagen. Wählen Sie rund 300 gleichmäßig große und gesunde Früchte und ziehen Sie die Stiele zurück. Tauchen Sie die grünen Kaffeefrüchte in eine 2% ige Seifenlösung und reinigen Sie sie gründlich, indem Sie sie reiben.
Dann spülen Sie die Früchte dreimal mit sauberem Wasser ab. Tauchen Sie sie in 0,5% ige Natriumhypochloritlösung und legen Sie sie für 10 Minuten bei 110 Umdrehungen pro Minute auf den Shaker. Spülen Sie die Früchte dreimal mit sauberem Wasser ab und trocknen Sie sie mit sterilen Papiertüchern.
Bestrahlen Sie die Früchte, indem Sie sie 15 Minuten lang 55 Zentimeter von der UV-Quelle entfernt in einer UV-fähigen horizontalen Laminar-Flow-Station platzieren. Bewegen Sie die Früchte alle fünf Minuten, um die richtige Bestrahlung der gesamten Frucht sicherzustellen. Um die Bioassays einzurichten, tauchen Sie die Kaffeebeerenzünsler, die am selben Tag aufgetaucht sind, in 0,5%ige Natriumhypochloritlösung und rühren Sie sie langsam mit einer Bürste für 10 Minuten auf.
Filtern Sie diese Insekten durch ein Musselintuch und waschen Sie sie dreimal mit sterilem destilliertem Wasser. Entfernen Sie überschüssiges Wasser mit sterilen Papiertüchern. Bereiten Sie eine Gruppe von 30 grünen Kaffeefrüchten pro Versuchseinheit zu und legen Sie sie in eine Plastikbox.
Wenden Sie verschiedene Konzentrationen eines Testprodukts zur Bewertung mit einer tragbaren Sprüheinheit an, hier wurden 5% und 6% Alkaloidemulsionen verwendet. Besprühen Sie als Kontrolle eine Gruppe grüner Kaffeefrüchte mit Wasser. Verwenden Sie mindestens drei Versuchseinheiten pro Behandlung und sprühen Sie nacheinander.
Lassen Sie in einer sterilen Kapuze zwei Kaffeebeerenzünsler pro grüner Kaffeefrucht los und bedecken Sie die Boxen nach 30 Minuten. Lassen Sie die Plastikboxen mit den befallenen grünen Kaffeefrüchten im Dunkeln in einem Raum oder Inkubator unter kontrollierten Bedingungen. Zählen Sie nach 1, 7, 15 und 21 Tagen die Anzahl der Zündfrüchte und lebenden und toten Insekten außerhalb der Früchte in jeder Box.
Sezieren Sie 20 Tage nach dem Befall jede grüne Kaffeefrucht unter einem Stereomikroskop mit 10-facher Vergrößerung und zählen Sie die Anzahl der gesunden Samen oder Samen, die von den Insekten in jeder Frucht beschädigt wurden. Zählen Sie die verschiedenen biologischen Stadien des Kaffeebeerenbohrers. Beobachten Sie die Anzahl der toten Insekten in jedem Samen, um die Insektensterblichkeit pro Versuchseinheit zu bestimmen.
In einer sterilen Haube die Kaffeebeerenzünsler Erwachsene im Verhältnis zwei zu eins an die zuvor desinfizierten grünen Kaffeefrüchte abgeben und den Befall drei Stunden bei 21 Grad Celsius andauern lassen. Die meisten grünen Kaffeefrüchte sollten nach drei Stunden befallen sein, wobei der Bauch des Kaffeebeerenzünslers noch freiliegt. Wählen Sie 46 befallene Früchte aus und legen Sie sie in ein 96-Well-Kunststoffgestell, damit die Behandlung direkt auf den Kaffeebeerenzünsler gesprüht werden kann, der die Früchte perforiert.
Besprühen Sie drei Racks mindestens dreimal zur Behandlung, nacheinander und decken Sie die Racks nach 30 Minuten ab. Sezieren Sie nach 20 Tagen die grünen Kaffeefrüchte unter einem Stereomikroskop mit 10-facher Vergrößerung und zählen Sie die Anzahl der gesunden Samen oder Samen, die von den Insekten in jeder Frucht beschädigt wurden. Zählen Sie die verschiedenen biologischen Stadien des Kaffeebeerenbohrers und die Anzahl der toten Insekten in jedem Samen, um die Insektensterblichkeit pro Versuchseinheit zu bestimmen.
Befolgen Sie die ersten Schritte zur Bewertung eines Produkts mit einer schützenden Wirkung auf die Früchte und geben Sie die grünen Kaffeefrüchte Erwachsene in die Plastikboxen frei. Dann zählen Sie die Anzahl der Kaffeebeerenzünsler, die von den Kisten wegfliegen, und die Anzahl, die die grünen Kaffeefrüchte befallen. Nach der Inkubation, unter kontrollierten Bedingungen, gefolgt von einer Dissektion in 20 Tagen nach dem Befall und dem Zählen der Samen und toten Insekten, befolgen Sie die Schritte zur Bewertung des Produkts nach dem Kaffeebeerenzünslerbefall.
Zählen Sie die Anzahl der Kaffeebeerbohrungen, die sich aus den grünen Kaffeefrüchten bewegten oder von den Früchten wegflogen. Befolgen Sie nach dem Sprühen jeder Behandlung die Schritte von der Inkubation unter kontrollierten Bedingungen, um die Insektensterblichkeit pro Versuchseinheit zu bestimmen. 5% und 6% Insektizid, das auf den Kaffeebeerenzünsler aufgetragen wurde, verursachte am 20. Tag eine hohe Insektensterblichkeit und zeigte signifikante Unterschiede im Vergleich zur Kontrolle.
Es wurde festgestellt, dass die Anwendung von Insektizid zwei zu 94% gesunder Samen und Insektizid eins zu 89% gesundem Saatgut führte. 37% der Samen waren in der Kontrollgruppe nicht befallen. Im Falle eines Nachbefalls drangen die Produkte in die Nagelhaut des Insekts ein und verursachten ein Insektensterben.
Die höchste Mortalität trat mit dem Insektizid zwei auf. Die Wirkung der Insektizide spiegelte sich am 20. Tag der Auswertung im Anteil gesunder nicht infizierter Samen wider. Eine reduzierte Insektenpopulation wurde in den Kaffeesamen gefunden, verglichen mit der Insektenpopulation in der Kontrollgruppe, die mit Wasser besprüht wurde.
Die kombinierte Wirkung von Entomopathogen und Repellent führte zu minimalen Samenschäden und maximaler Insektensterblichkeit. Diese Infektion der Früchte und die Desinfektion der Insekten sichern den Protokollerfolg. Diese Methodik kann auch zur Bewertung der Toleranz oder Resistenz von Kaffeefrüchten gegenüber dem Kaffeebeerenzünsler verwendet werden.
Ein negativer Effekt kann auch gegen die Insektenpopulation bei insektenresistenten Kaffeesamen beobachtet werden. Diese Methodik kann nicht nur in der Entomologie zur Bewertung von Insektiziden mit verschiedenen Wirkungsweisen eingesetzt werden, sondern auch in der Pflanzenzüchtung zur Bewertung toleranter Sorten und der Pflanzenpathologie zur Untersuchung der Frucht-pathogen-Interaktion.
