Diese Methode ist von Bedeutung, da von Patienten abgeleitete Organoide ein schnelles und leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung urologischer Krebserkrankungen darstellen, da sie häufig die genetische und phänotypische Heterogenität dieser Multispektrum-Krankheit nachahmen. Organoide können aus einer begrenzten Menge an Patientenbiopsiematerial isoliert und für die nachgelagerte Analyse schnell erweitert werden. Die mit diesem Protokoll erzeugten Organoide können sowohl als Modelle verwendet werden, um die zellulären und molekularen Grundlagen urologischer Krebserkrankungen zu verstehen, als auch als präzisionsmedizinische Werkzeuge, mit denen wir vorhersagen können, auf welche Behandlungen und einzelnen Patienten Krebs ansprechen könnte.
Sammeln Sie zunächst eine frische makroskopisch lebensfähige Tumorprobe aus der Operation und stellen Sie sicher, dass die Probe während des Transports in ein steriles 50-Milliliter-Konusröhrchen oder Urinprobenglas in ein Transportmedium eingetaucht wird. Notieren Sie Probendetails, einschließlich Gewebegewicht, Probenbeschreibung und Details zu Blut- und Urinproben auf dem Verarbeitungsblatt für Patientenproben. Ersetzen Sie das Transportmedium vorsichtig durch 10 Milliliter Basalmedien und lassen Sie das Tumorgewebe durch Schwerkraft absetzen.
Als nächstes entfernen Sie mit einer Pinzette das Tumorgewebe und legen es in eine sterile 90-Millimeter-Petrischale. Notieren Sie das Gewicht des Gewebes in Gramm oder Milligramm auf dem klinischen Probenverarbeitungsblatt und dem Seziergitter. Entfernen Sie dann mit einer sterilen Pinzette in einer Einweg-Skalpellklinge, die an einem Skalpellgriff montiert ist, das nicht krebsartige Gewebe und die makroskopisch sichtbaren nekrotischen Regionen.
Waschen Sie die Tumorstücke ein- bis zweimal mit kaltem DPBS, sammeln Sie sie dann und geben Sie sie in eine neue sterile 90-Millimeter-Petrischale. Machen Sie ein Foto, zeichnen Sie ein Gewebediagramm und planen Sie die Gewebedissektion auf einem klinischen Verarbeitungsgitter. Für die histopathologische Analyse legen Sie etwa 50 Milligramm des Tumorgewebes in eine markierte Einweg-Plastikhistologiekassette.
Tauchen Sie dann die Histologiekassette in einen Behälter mit 5X bis 10X Volumen von 10% neutralem gepuffertem Formalin und inkubieren Sie über Nacht. Ersetzen Sie am folgenden Tag das Formalin durch 70% Ethanol für die Lagerung bei vier Grad Celsius, bis das Gewebe verarbeitet werden kann. Für die molekulare Analyse mindestens ein Tumorstück in einer RNase, DNase-freiem 1,5-Milliliter-Kryo mit flüssigem Stickstoff einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern.
Als nächstes geben Sie fünf Milliliter Organoidmedium in die 90-Millimeter-Petrischale mit den restlichen Tumorstücken ab und zerkleinern das Gewebe mechanisch so fein wie möglich. mit einer sterilen Skalpellklinge Nummer 10. Übertragen Sie das fein gehackte Gewebe in eine 50-Milliliter-konische Röhre und fügen Sie vier Milliliter Organoidmedium, einen Milliliter 10-fache Kollagenase / Hyaluronidase und 0,1 Milligramm pro Milliliter DNase I hinzu, um Zellverklumpungen zu vermeiden.
Inkubieren Sie das zerkleinerte Tumorgewebe in Enzymlösung für ein bis zwei Stunden auf einem Orbitalshaker oder Rotator in einem Inkubator, um Fragmente in eine Zellsuspension zu dissoziieren und Kollagene abzubauen. Stoppen Sie dann den Aufschluss, indem Sie der Probe das doppelte Volumen an basalem Medium hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Probe, saugen Sie den Überstand ab und verwerfen Sie ihn.
Als nächstes, um kontaminierende rote Blutkörperchen zu lysieren, suspendieren Sie das Pellet in fünf Milliliter Ammoniumchlorid-Kaliumpuffer und inkubieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur für drei Minuten oder bis die vollständige Lyse der roten Blutkörperchen gesehen wird. Dann 20 Milliliter Basalmedium in die Tube geben. Zentrifugieren Sie erneut und saugen Sie den Überstand ab.
Legen Sie bei diesem Schritt ein 10 Milliliter Aliquot aus 2X und 1X Organoidmedium in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad. Filtern Sie die Probe zuerst durch ein vornasses reversibles 100-Mikron-Sieb in ein neues 50-Milliliter-Rohr, um großes unlösliches Material zu entfernen. Filtern Sie dann die Elute durch ein vornasses reversibles 37-Mikron-Sieb, um einzelne Zellen in kleinen Clustern für die Einzelzell- und Immunzellisolierung zu sammeln.
Als nächstes kehren Sie das 37-Mikron-Sieb um und fügen Sie 10 Milliliter Basalmedien hinzu, um kleine und mittelgroße Cluster zu sammeln. Füllen Sie jedes dieser neuen 50-Milliliter-Röhrchen mit DPBS auf 40 Milliliter auf, zentrifugieren Sie dann die Suspension und entsorgen Sie den Überstand. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter Basalmedien zu dem Röhrchen hinzu, das die einzelnen Zellen enthält, und zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Ausschlussfarbstoff in einem automatisierten Zellzähler.
Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit von Zellen. Zentrifugieren Sie die restliche Probe und ersetzen Sie das Medium durch Zellgefrierlösung oder Basalmedien, die 10% fetales Rinderserum 1% Penicillin und Streptomycin und 10% DMSO enthalten, dann legen Sie die Proben in 1,5 Milliliter Kryofrüchte, lagern Sie sie in einem selbstgefrierenden Behälter und geben Sie die Behälter sofort in einen Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Am nächsten Tag werden die Kryogene zur Langzeitlagerung in eine kryogene Flüssigkeits- oder Luftphasenlagerung überführt.
Als nächstes resuspendieren Sie die gesammelten kleinen und mittelgroßen Cluster mit 500 Mikrolitern vorerwärmtem 2X-Organoidmedium. Dann mit eiskalten P-1000 sterilen Filterpipettenspitzen BME in die Zellen geben und vorsichtig mischen. Pipettieren Sie schnell und vorsichtig 100 Mikroliter der rekonstituierten BME-Mischung der Zellen in Vertiefungen mit extrem niedriger Befestigung, flacher 96-Well-Platte und legen Sie die Platte für 20 bis 30 Minuten in einen Inkubator, um sie zu verfestigen.
Nach der Inkubation fügen Sie Organoidmedium auf die BME-Zellsuspension in einem Verhältnis von eins zu zwei hinzu, abhängig vom empirisch bewerteten Volumen, und legen Sie die Platte für 20 Minuten in einen Inkubator, um sich auszugleichen. Entfernen Sie nach der Inkubation die Platte aus dem Inkubator und montieren Sie sie auf einem Probenhalter auf dem Tisch eines Mikroskops, um Organoide visuell unter Phasenkontrast- oder Hellfeldeinstellungen zu beurteilen. Füllen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage mit 50 Mikrolitern vorerwärmtem Organoidmedium auf, um erschöpfte Wachstumsfaktoren und das Gesamtvolumen wieder aufzufüllen.
Erfassen Sie die Bilder der Zeitrafferserie an den Tagen 1, 2 und 3 sowie 5, 7 und 10, bevor Sie vergehen. Die zweistündige Verdauung von Blasenkrebsgewebe mit kommerziell erhältlicher Kollagenase/Hyaluronidase und DNase I führt zu einer ausreichenden Verdauung von 0,5 bis 1 Kubikmillimeter Stück komplexerer Zystektomiebiopsiegewebe, einschließlich der neoplastischen Zellen in der Lamina propria und den Muskelschichten der Blase. Größere Post-Digestion-Fragmente eignen sich für Kultur- und Standard-Gewebekulturplatten beliebiger Größe, um neuartige zweidimensionale Kulturen zu isolieren.
Organoide, die durch dieses Verfahren erzeugt werden, durchlaufen eine dynamische Selbstorganisation, einschließlich Phasen der Aggregation, Verdichtung und endgültigen Bildung enger zellulärer Strukturen. Histologisch rekapitulieren diese Strukturen den ursprünglichen Patiententumor. Organoide, die in diesem Verfahren erzeugt werden, eignen sich für viele Zwecke, einschließlich weiterer histopathologischer Charakterisierung, Biobanking und Arzneimittelwirksamkeitstests.
Nach der Generierung von Organoiden können zusätzliche Methoden verwendet werden, um diese Tumoren zu profilieren, einschließlich der Rolle von Krebstherapien, metabolischem Profiling oder Transkriptionsprofiling. Innerhalb dieses 3D-Rahmens bieten diese zusätzlichen Methoden einen starken Einblick in die Biologie von Blasenkrebs. Diese Methode war eine wichtige Grundlage für Studien, die die Immunonkologie und den Zellstoffwechsel untersuchten.
