Das Protokoll präsentiert Drosophila-Modelle, bei denen die Herzfunktion mit Licht charakterisiert und gesteuert werden kann. Dies ermöglicht es Forschern, menschliche Herzkrankheiten bei Drosophila an intakten Tieren zu untersuchen. Mit dieser Methode können eine nicht-invasive OCT-Bildgebung und optogenetische Kontrolle der Drosophila-Herzfunktion zuverlässig erreicht werden.
Es hat eine hohe Effizienz und Qualität. Das optogenetische Pacing kann möglicherweise eine Alternative zum elektrischen Pacing als Therapie zur Behandlung arrhythmischer Störungen sein. OCT-Bildgebung und optogenetische Stimulierung können auf andere Modellsysteme wie Herzorganoide, Zebrafische und embryonalen Hals und Herz ausgedehnt werden.
Kombinieren Sie zunächst fünf Hand GAL4 über TM6 Doppeltubby jungfräuliche Weibchen und zwei bis drei männliche Fliegen von UAS Ops und Stocks pro Fläschchen. Am nächsten Tag bereiten Sie halb definierte Lebensmittel nach den Anweisungen des Bloomington Drosophila Stock Center zu, indem Sie 5,14 Gramm pro 100 Milliliter Saccharose in einen Behälter auf einer heißen Platte geben. Anschließend unter ständigem Rühren auf 60 Grad Celsius abkühlen.
Als nächstes bereiten Sie schmale Fläschchen vor, indem Sie 50 Mikroliter 100 Millimolar all-trans-retinale Ethanollösung zu jeder Durchstechflasche hinzufügen. Verwenden Sie eine serologische Pipette, um fünf Milliliter Fliegenfutter pro schmaler Fliege zu entsorgen. Nachdem Sie 10 Sekunden lang mit maximaler Geschwindigkeit gewirbelt haben, stecken Sie diese Fläschchen ein und wickeln Sie sie in den dunklen Stoff, um sie vor Licht zu schützen.
Am nächsten Tag übertragen Sie die Fliegen, die stetig Eier legen, in die Fläschchen mit all-trans-Netzhautethanol, das Nahrung enthält. Schützen Sie die Racks mit Durchstechflaschen vor Licht. Nach 24 bis 48 Stunden, abhängig von der Anzahl der gelegten Eier, verwerfen Sie die Eltern, um eine Überbevölkerung der Fläschchen zu verhindern.
Als nächstes sammeln Sie Nicht-Tubby-Nachkommen für die Herzbildgebung. Wählen Sie die UAS-Option GAL4-Larve oder -Puppe aus der Durchstechflasche, legen Sie sie auf ein Taschentuch und wischen Sie das Medium vorsichtig mit einem Malpinsel von der Körperoberfläche ab. Bereiten Sie den Objektträger mit einem kleinen Stück doppelseitigem Klebeband in der Mitte vor.
Als nächstes legen Sie die Larve oder Puppe vorsichtig mit der Rückenseite nach oben und senkrecht zur Längsseite des Objektträgers mit einer Bürste oder einer feinen Pinzette auf die Bandoberfläche. Üben Sie leichten Druck aus, um die Larve oder Puppe an der Oberfläche des Bandes zu befestigen. Stellen Sie nun den Objektträger auf dem Bildgebungsstadium mit der Larve oder Puppe nach unten auf und schalten Sie die optische Kohärenztomographie oder OCT-Lichtquelle per Lasersteuerungssoftware ein.
Öffnen Sie die benutzerdefinierte OAT-Steuerungssoftware für die Spektraldomäne. Klicken Sie dann auf das Vorschaufenster. Legen Sie dann die Scanparameter in der OAT-Software für den Spektralbereich fest.
Verwenden Sie Mikromanipulatoren, um das Probenstadium zu steuern, um das Fliegenherz in den Fokus zu bringen. Stellen Sie die Fokusposition ein, um die Lichtreflexion von der Oberfläche der Fliegenkutikula zu minimieren. Erwägen Sie auch, Mineralöl auf die Larven- oder Puppenoberfläche aufzutragen, um die Reflexion zu minimieren.
Stellen Sie als Nächstes die Scanparameter für die OCT-Bildaufnahme im M-Modus ein und erfassen Sie fünf Steuerdatensätze ohne Rotlichtstimulationsimpulse, um die Ruheherzfrequenz zu berechnen. Entwerfen Sie den Lichtimpuls für die Schrittmacherstimulation in der benutzerdefinierten OCT-Steuerungssoftware. Klicken Sie dazu auf die Einstellungsregisterkarten und fügen Sie die entworfenen Lichtpulssequenzen hinzu, um Pulsfrequenz, Pulsbreite, Stimulationsdauer und Wartezeit nach verschiedenen Stimulationsprotokollen zu steuern.
Öffnen Sie dann die Lichtsteuerungssoftware, um rote Lichtimpulse zu erzeugen. Wählen Sie in der Modusauswahl den Pulsmodus. Doppelklicken Sie auf die Abbildung für die Einstellungen des Pulsprofils und wählen Sie den Follower-Modus.
Halten Sie die Intensität bei Null und legen Sie den Prozentsatz der Ein-Intensität bei der Berechnung der tatsächlichen Leistungsdichte fest. Erfassen Sie M-Modus-Videos des schlagenden Drosophila-Herzens mit Lichtstimulation, indem Sie in der OCT-Steuerungssoftware auf Erfassen klicken. Zeichnen Sie während der Bildgebungsaufnahme rote Lichtblitze am Fliegenherzen auf.
Beachten Sie, dass unterschiedliche Schrittmachereinstellungen erforderlich sind, um die Fliegenherzfunktion mit rotverschobenen Kanalrhodopsin- und NPHR-Fliegenmodellen zu steuern. Öffnen Sie die speziell entwickelte Fliegenherz-Segmentierungssoftware und klicken Sie auf Datei auswählen. Wählen Sie dann die zu analysierende Datei in der grafischen Benutzeroberfläche aus.
Geben Sie sowohl die vertikalen als auch die horizontalen Grenzen der Herzregion in Pixel in die oberen Textfelder ein. Klicken Sie auf Größe ändern. Stellen Sie mit dem Schieberegler unten sicher, dass die gesamte Herzregion sichtbar ist und die gesamte Box für die gesamte Kollektion ausgefüllt wird.
Nachdem Sie auf die Registerkarte "Vorhersagen" geklickt haben, durchläuft das Programm jedes Segment in der Sammlung und wählt die Herzregion in etwa drei Minuten aus. Sobald die Vorhersage abgeschlossen ist, klicken Sie auf das HR-Diagramm, um ein Diagramm des Herzbereichs im Zeitverlauf in einem neuen Fenster anzuzeigen. Wählen Sie die richtigen Peak- oder Valley-Bereiche aus, wählen Sie den Puls und dann die HR-Registerkarten, um eine endgültige Zahl zu generieren.
Die Funktionsparameter werden gleichzeitig in den CSV-Dateien gespeichert. Die Gewebespezifität des Hand-GAL4-Treibers wurde durch die Abbildung der grün fluoreszierenden Proteinexpression überprüft. Hier werden die typischen OCT-Bilder von Larven- und Puppenkörperquerschnitten gezeigt.
Um verschiedene Herzerkrankungen nachzuahmen, wurden vier Arten von Lichtimpulsen entwickelt. Ein einzelner Puls, der nach fünf Sekunden Wartezeit 10 Sekunden dauerte, erzeugte einen wiederherstellbaren Herzstillstand. Für die Herzfrequenz bei Frequenzen, die niedriger als die Ruheherzfrequenz sind, wurden zwei leichte Pulssequenzen mit Schrittfrequenzen verwendet, die der Hälfte der Ruheherzfrequenz entsprechen, und ein Viertel der Ruheherzfrequenz, die acht Sekunden dauert, mit einer Wartezeit von sechs Sekunden dazwischen.
Das Stimulationsmuster zur Erhöhung der Herzfrequenz aufgrund der rotverschobenen Kanalrhodopsinaktivierung bestand aus drei Sequenzen von Lichtpulsen. Die reduzierte Herzkontraktionsfrequenz nach den Lichtsignalen führte zu einer langsameren Herzfrequenz, die in Larve und Puppe nachahmt. Eine Serie von drei Lichtpulszügen mit unterschiedlichen Stimulationsfrequenzen wurde auf Larven aufgetragen und Puppenherzen zeigten deutlich eine erhöhte Herzfrequenz nach den Lichtimpulsen.
Die Auswahl der richtigen Nachkommen, die Montage der Probe und das bildgebende Verfahren sind unerlässlich. Wir hoffen, die optogenetische Stimuling-Technologie auf größere Tiermodelle zu übertragen, Herzkrankheiten von Säugetieren zu untersuchen und neue therapeutische Ansätze zur Behandlung von Arrhythmien zu erforschen.
